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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012)

23.10. - 26.10.2012, Berlin

In vitro-Assay zur Prüfung von Knochenersatzstoffen: Bestimmung zellulärer Parameter von MSC und EPC auf Orthoss, Chronos und Tutoplast

Meeting Abstract

  • presenting/speaker Ilonka Karl - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany
  • Carina Poppe - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany
  • Kerstin Wilhelm - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany
  • Caroline Seebach - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany
  • Dirk Henrich - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany
  • Ingo Marzi - Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Klinikum der Johnann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012). Berlin, 23.-26.10.2012. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2012. DocPO14-682

DOI: 10.3205/12dkou567, URN: urn:nbn:de:0183-12dkou5678

Published: October 2, 2012

© 2012 Karl et al.
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Fragestellung: Der Einsatz von Knochenersatzstoffen, die auch potentiell – im Sinne des Tissue Engineering – mit Zellen besiedelt, in Defekte eingebracht werden können, gewinnt in der Unfallchirurgie immer mehr von Bedeutung. Für die prä-klinische Prüfung bieten sich standardisierte in vitro-Zellkulturmodelle an.

In einem von uns etablierten in vitro-Test-Assay im 96 well Platten-Format mit primären, humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) bzw. endothelialen Vorläuferzellen (EPC) lassen sich Zell-spezifische Kompatibilität (Adhäsion,Viabilität, Proliferation), angiogenes (EPC-Differenzierung) und osteogenes (MSC-Differenzierung) Potential verschiedener Materialien evaluieren. Am Beispiel einer Vergleichsstudie der Knochenersatzmaterialien Orthoss (bovines Spongiosagranulat), Chronos(synthetisches b-TCP) und Tutoplast (humanes Spongiosagranulat) stellen wir dieses Testsystem vor.

Methodik: Für die Prüfung wurden primäre, humane mesenchymale Stammzellen (MSC) und primäre humane endotheliale Vorläuferzellen (EPC) von je 5 Donoren auf den unbeschichteten Knochenersatzstoffen (Orthoss Spongiöse Granulat, 1-2 mm, Geistlich; Chronos Granula 0,7-1,4 mm, Synthes; Tutoplast Spongiosa 1-2 mm, Tutogen) in 96 well Platten ausgesät und kultiviert. Die Zellentnahme ist durch ein Ethikvotum gedeckt. An den Messtagen (d=2, 6, 10, bei MSC-Kulturen zusätzlich 14) erfolgte die Bestimmung der zellulären Parameter Viabilität/Proliferation (mikroskopische Bestimmung der Zellzahl nach Färbung der Zellkerne mit DAPI, kolorimetrischer MTT-Assay zur Bestimmung der metabolischen Aktivität bzw. fluorometrische Bestimmung des DNA-Gehalts mit CyQuant), Morphologie (REM) und Differenzierung (Nachweis der Expression spezifischer osteogener bzw. endothelialer Marker-Gene mittels realtime RT-PCR) (Statistik: Kruskal-Wallis-Test, p<0,05 ist signifikant).

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: MSC- als auch EPC-Kulturen konnten sich auf Chronos und Tutoplast etablieren und blieben für den gesamten Messzeitraum viabel. Die REM-Untersuchungen zeigten Zellverbände mit gut ausgebildeten Zell/Substrat als auch Zell/Zell-Kontakten. Auch die Expression spezifischer Marker-Gene konnte für beide Materialien nachgewiesen werden. Zellzahl (Fluoreszenzmikroskop, DNA) und metabolische Aktivität von MSC und EPC waren im Vergleich zu Chronos bzw. Tutoplast über den gesamten Beobachtungszeitraum auf Orthoss signifikant erniedrigt (z.B. Anzahl adhärenter MSC am Tag 2: Orthoss 673±510, Chronos 3315±1590, Tutoplast 4824±1302; angegeben sind die Mediane ± Interquartilsabstand aus den MTT-Messungen durch Eichreihen auf Zellzahlen umgerechnet).

Die Untersuchung ergab eine signifikant verringerte Zelladhäsion auf bovinen Spongiosagranulat. Die Adhärenz könnte durch eine entsprechende Vorbehandlung mit Fibronectin verbessert werden.

Mit dem Testsystem im 96 well Platten-Format konnten wir ein standardisiertes Testsystem etablieren, dass nach festgelegten Qualitätsstandards validiert und zur Prüfung von verschiedensten Materialien eingesetzt werden kann.