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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
72. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 94. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie und 49. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

22. - 25.10.2008, Berlin

In vitro Charakterisierung Tet-regulierter, lentiviral vermittelter BMP-2 Expression in primären Kaninchen-Chondrozyten

Meeting Abstract

  • D. Wübbenhorst - Klinikum rechts der Isar, Institut für experimentelle Onkologie, München, Germany
  • G. Wexel - Klinikum rechts der Isar, Institut für experimentelle Onkologie, München, Germany
  • R. Burgkart - TU München, Klinikum rechts der Isar, Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, München, Germany
  • A.B. Imhoff - TU München, Klinikum rechts der Isar, Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, München, Germany
  • B. Gänsbacher - Klinikum rechts der Isar, Institut für experimentelle Onkologie, München, Germany
  • M. Anton - Klinikum rechts der Isar, Institut für experimentelle Onkologie, München, Germany
  • S. Vogt - TU München, Klinikum rechts der Isar, Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie, München, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 72. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 94. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 49. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 22.-25.10.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. DocEF12-898

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dkou2008/08dkou022.shtml

Veröffentlicht: 16. Oktober 2008

© 2008 Wübbenhorst et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Aufgrund der begrenzten Selbstheilungskapazität stellt die Behandlung von Knorpeldefekten weiterhin eine Herausforderung dar. Ein kombinierter gen- und zelltherapeutischer Ansatz für die Produktion des Wachstumsfaktors BMP2 erscheint vielversprechend. Um ein potenzielles onkogenes Risiko durch Dauerexpression von BMP2 auszuschließen, ist eine regulierte/reversible Expression erstrebenswert.

Methodik: Die Experimente wurden sowohl mit der chondrogenen Zelllinie ATDC5 als auch mit primären Kaninchen-Chondrozyten (CZ) durchgeführt. Zur Regulation der Genexpression wurde das Tet on-System verwendet. Der Gentransfer erfolgte durch VSV-G pseudotypisierte, selbst-inaktivierende lentivirale Vektoren. Die Zellen wurden dafür mit zwei verschiedenen Vektoren koinfiziert, welche den reversen Transaktivator beziehungsweise eGFP oder BMP2 unter Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements exprimieren. Die Transgenexpression wurde anschließend durch Zugabe von Doxycyclin induziert. EGFP exprimierende Zellen wurden mittels FACS-Messung, BMP2 exprimierende Zellen durch BMP2 ELISA analysiert. Sowohl BMP2 als auch Col1, Col2 und Sox9 Expression wurde durch qRT-PCR analysiert. Die Synthese von Proteoglykan wurde durch Alzian-Blau-Färbung gezeigt. Weiterhin wurde ein Ein-Vektor-System, welches die kodierenden Sequenzen für Transaktivator und Transgen auf einem Plasmid vereinigt, konstruiert.

Ergebnisse: Die Effizienz des Tet on-Systems wurde zunächst mit Hilfe des eGFP Transgens überprüft. Nach der Induktion durch Doxycylin konnte ein 32-facher bzw. 6-facher Anstieg der Fluoreszenzintensität in ATDC5-Zellen bzw. CZ gemessen werden. Der analoge Versuchsaufbau unter Verwendung des BMP2 Transgens führte zu einer Produktion von 14ng/ml BMP-2 in CZ nach Doxycyclin-Induktion, wohingegen keine BMP2 Produktion im nicht-induzierten Ansatz nachweisbar war. Die Verwendung des Ein-Vektor-Systems führte gegenüber dem Ko-Infektionsansatz nach Doxycylin-Induktion zu erhöhter BMP2 Expression. Die Untersuchung der Kinetik der Induktion und des Abschaltens der Genexpression zeigte nach 5 Tagen und wiederholter Doxycyclin-Gabe eine maximale Induktion der eGFP- und BMP2-Expression in ATDC5-Zellen und CZ. Die Halbwertszeit des Abschaltens für das BMP2-Transgen ist deutlich kürzer als für eGFP. Die Funktionalität des entweder konstitutiv oder reguliert synthetisierten BMP2 konnte durch die Bildung von Proteoglykanen nachgewiesen werden.

Schlussfolgerung: Das lentiviral vermittelte Tet on-System ermöglicht eine regulierte Expression sowohl in chondrogenen Zelllinien als auch in primären Kaninchenchondrozyten. Nach der Induktion ist die durch CZ synthetisierte BMP2 Menge in vitro ausreichend für die Bildung von Proteoglykanen, ein Zeichen für die Funktionalität des BMP2. Diese Versuche zeigen, dass lentivirale Vektoren sehr wahrscheinlich geeignet sind, um mit deren Hilfe eine regulierte Produktion von Wachstumsfaktoren in-vivo zur Therapie von Knorpeldefekten zu erreichen.