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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
71. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 93. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie und 48. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

24. - 27.10.2007, Berlin

Quantitative RT-PCR zur Bestimmung des funktionellen lentiviralen Titers nach ex vivo Gentransfer in humanen mesenchymalen Stammzellen

Meeting Abstract

  • W. Böcker - Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
  • O. Rossmann - Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
  • W. Mutschler - Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
  • M. Schieker - Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 71. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 93. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 48. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 24.-27.10.2007. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2007. DocE35-1398

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dkou2007/07dkou179.shtml

Veröffentlicht: 9. Oktober 2007

© 2007 Böcker et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) sind ein viel versprechendes Ziel für ex vivo Gentherapie und Lentiviren sind ausgezeichnete Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsraten mit lang anhaltender Genexpression erreichen. Dennoch limitiert die Zellalterung von hMSCs den therapeutischen Einsatz aufgrund zeitaufwendiger Zellselektionierungen und Virustitrationen. Für die gentherapeutische Anwendung ist deshalb die Bestimmung der funktionellen lentiviralen Titer wünschenswert. Wir beschreiben hier erstmals die Bestimmung der funktionellen lentiviralen Titer mit Hilfe der quantitativen RT-PCR (pRT-PCR) nach hoch-effizientem ex vivo Gentransfer in hMSCs.

Methodik: Die Effizienz der Lentivirus-Herstellung wurde mit verschiedenen Packungssystemen in hMSCs untersucht. Hierfür wurde das Markergen eGFP in hMSCs überexprimiert, und die Transduktionseffizienz mittels FACS bestimmt. Zum Nachweis infektiöser viraler Partikel wurde ein p24 ELISA des Zellkulturüberstandes durchgeführt. Die Virusverdünnung wurde mit der Höhe der Transgen-Expression in der qRT-PCR korreliert. Der erhaltende Stammzell-Charakter wurde durch osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierung untersucht.

Ergebnis: Selbst-inaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten eine Transduktionseffizienz von >98%. Nach 4 Tagen und 4 Medienwechseln konnten keine infektiösen Partikel mehr im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden. Es bestand eine lineare Korrelation zwischen Virus-Verdünnung und Transgen-Expression, wodurch sich die funktionellen lentiviralen Titer mit Hilfe der qRT-PCR bestimmen ließen. Der Beweis, dass der Stammzellcharakter erhalten blieb wurde mittels Differenzierungsassays erbracht.

Zusammenfassung: Die Quantifizierung der Transgen-Kopienzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bestimmung der funktionellen lentiviralen Titer nach ex vivo Gentransfer in hMSCs.