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67. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie
89. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie
44. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie

11. bis 16.11.2003, Messe/ICC Berlin

Visualisierung und Quantifizierung der Cathepsin B-, K- und L-Aktivität in vitalen Knorpelzellen

Meeting Abstract (DGOOC 2003)

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  • corresponding author Anke Köcher - Lehrstuhl für Orthopädie der FSU Jena, Klosterlausnitzer Straße 81, 07607, Eisenberg, Phone: 036691/81086, Fax: 036691/81093
  • J. Mollenhauer - Lehrstuhl für Orthopädie der FSU Jena
  • B. Wiederanders - Institut für Biochemie I des Klinikums der FSU Jena

Deutsche Gesellschaft für Unfallchirurgie. Deutsche Gesellschaft für Orthopädie und orthopädische Chirurgie. Berufsverband der Fachärzte für Orthopädie. 67. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 89. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie und 44. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 11.-16.11.2003. Düsseldorf, Köln: German Medical Science; 2003. Doc03dguS2-2

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgu2003/03dgu1051.shtml

Veröffentlicht: 11. November 2003

© 2003 Köcher et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung

Proteolytische Enzyme wie Cathepsin B, K und L sind an zahlreichen pathologischen Prozessen beteiligt. Der Anteil der einzelnen Protease an der destruktiven Aktivität ist aber mit der effektiv vorhandenen Enzymaktivität verbunden. Dafür wurde eine Darstellung der Proteaseaktivität in lebenden Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenzassays versucht.

Methodik

Zur Visualisierung der Cathepsinaktivität wird dem serumfreien Medium ein spezifisches Substrat und ggf. ein spezifischer Inhibitor zugesetzt. Das native Enzym spaltet das synthetische Substrat. Dabei entsteht ein fluoreszierender Niederschlag, der im Mikroskop lokalisiert bzw. photometrisch gemessen werden kann. Zur Charakterisierung der Cathepsinaktivität werden spezifische Proteaseinhibitoren verwendet. Die mikroskopische Auswertung erfolgt mittels einer FITC-Filterkombination und Blaulichtanregung. Die Quantifizierung der Ergebnisse wird durch den Einsatz eines Fluor-S-MultiImagers ermöglicht.

Ergebnisse

Der Assay ermöglicht durch den Einsatz spezifischer Proteaseinhibitoren die Visualisierung und Quantifizierung der Cathepsin B-, K- und L-Aktivität in vitalen Knorpelzellen. Derselbe Ansatz dieses Fluoreszenzassays im 96-well Format läßt eine Quantifizierung der Aktivität zu. Die Expression der Cathepsine wurde zusätzlich durch einen cDNA-Array bestätigt.

Schlußfolgerung

Durch diesen Assay gelingt die Darstellung der Cathepsinaktivitäten an lebenden Zellen in Kultur. Durch die Einführung des Mikroplattenformates kann dieses Verfahren auch zur Testung pharmakologisch relevanter Inhibitoren verwendet werden.