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125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

22. - 25.04.2008, Berlin

Etablierung eines Nachweises direkter antibakterieller Wirkung humaner Defensine für die Untersuchung der Defensinproduktion im menschlichen Darm bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa

Meeting Abstract

  • A. Andreou - Chirurgische Klinik I, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • A. Coordes - Chirurgische Klinik I, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • U. Erben - Medizinische Klinik für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • K. Blunert - Medizinische Klinik für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • corresponding author N. Slavova - Chirurgische Klinik I, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • H.J. Buhr - Chirurgische Klinik I, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • A.J. Kroesen - Chirurgische Klinik I, Campus Benjamin Franklin, Charité

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. Berlin, 22.-25.04.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc08dgch9720

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2008/08dgch463.shtml

Veröffentlicht: 16. April 2008

© 2008 Andreou et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: Als Teil der angeborenen Immunität erhalten Defensine die intestinale Mukosabarriere mit aufrecht, die in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) beeinträchtigt ist. Ein funktioneller Vergleich von der antibakterieller Wirkung von Defensinen aus dem Darmgewebe von Patienten mit CED im Vergleich zu solchen aus nicht entzündetem Darm ist sehr wichtig. Für einen unmittelbaren experimentellen Vergleich kommen nur Defensine selbst in Frage, da ihre Wirkmechanismen im Detail nicht bekannt sind.

Material und Methoden: Die antibakterielle Aktivität wurde durch die Änderung der optischen Dichte einer wachsenden Bakterienkultur bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600nm) erfasst und die Bedingungen für die Bakterienanzucht mit Ampicillin als Standard optimiert. Eine cDNA, die für die 42 Aminosäurereste des reifen hBD-2 kodiert, wurde mit rekombinanten Standardtechniken in einen Vektor für die induzierbare Expression als Fusionsprotein mit der Glutathion-S-Transferase (GST) kloniert. In E.coli BL21 Star™ zytoplasmatisch exprimiertes hBD-2-GST wurde affinitätschromatographisch über Glutathion-Sepharose in einem Schritt aus Bakterienlysaten gereinigt. Präparierte menschliche Darmepithelien wurden mit einem gepufferten Gemisch aus Acetonitril und Trifluoressigsäure extrahiert und die Überstände lyophilisiert.

Ergebnisse: Es wurde E.coli JM109 als Stamm mittlerer Empfindlichkeit in Kulturmedium nach Luria und Bertani/Lennox (LB-Medium) verwendet. Die standardisierten Bedingungen für die Kulturführung beinhalten: (i) Ansetzen der Vorkultur aus Einzelkolonien von Übernachtkulturen frischer Ausstriche auf LB-Agar, (ii) Vorkulturen ohne Antibiotika in LB-Medium bis zu einer OD600 nm ~0,25-0,32 und (iii) Hauptkulturen in mit 1/6 mit Wasser verdünntem LB-Medium, in Gegenwart der antibiotisch wirksamen Substanz bis zu einer OD600 nm ~0,65-0,75 in der Kontrollkultur ohne Antibiotikum. Unter diesen Bedingungen wurde für Ampicillin eine halbmaximale inhibitorische Konzentration von 1,85 μg/ml ermittelt.Das gereinigte hBD-2-GST-Fusionsprotein reduzierte die maximale OD600nm der Bakterienkultur um ca. 0,1 und war damit weniger wirksam als Ampicillin. Das Entfernen des für die Bakterien nicht-toxischen Glutathion aus der hBD-2-GST-Präparation führte zum vollständigen Verlust der biologischen Aktivität. Aus den rehydratisierten lyophilisierten Extrakten aus menschlichen Darmepithelien konnte keine antibakterielle Aktivität, die auf die Wirkung von Defensinen zurückgeht, gefunden werden, da sich die Puffer- und Lösungsmittelreste aus der Probenaufarbeitung in dem etablierten Bioassay bereits als stark bakterizid erwiesen.

Schlussfolgerung: Mit Hilfe eines etablierten und empfindlichen densitometrischen Assay kann die antibakterielle Wirkung von hBD-2 auch nach der rekombinanten Fusion des Moleküls mit der GST nachgewiesen werden. Der Verlust der biologischen Aktivität nach Entzug des Glutathion könnte auf Aggregationen zurückzuführen sein, die auch bei der denaturierenden Aufarbeitung der Darmproben wahrscheinlich sind. Neben der Lösungsmittelempfindlichkeit der biologischen Nachweismethodik ist auch diese Neigung zu möglichen inaktivierenden konformationellen Änderungen in den Prozeduren für die Probenaufarbeitung zu berücksichtigen.