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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis und Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instandev.de). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 15 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“: so wurde beispielsweise im aktuellen RV 535 Borrelia burgdorferi eine Probe mit Borrelia bissetii versandt, die innerhalb der 18 Borrelia burgdorferi sensu lato Spezies bisher nur sehr selten in klinischem Probenmaterial beobachtet bzw. nachgewiesen werden konnte. Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 534 ein Shiga-Toxin 2f (stx-2f)-positives EHEC-Isolat ausgesandt, das erwartungsgemäß nicht von allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen EHEC-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen detektiert werden konnte. Die Gensequenz von stx-2f weist bekanntermaßen relativ wenig Homologie zu den übrigen Shiga-Toxin-Gensequenzen auf und zudem ist dessen humanpathogene Relevanz nach wie vor etwas umstritten. Aber mehr dazu im EHEC-spezifischen Teil dieser Ringversuchsdiskussion. Mit der Probe # 1325434 des RV 543 wurde erstmalig auch DNA der „4.“ Subspezies, von F. tularensis (spp. novicida) ausgesandt. Stämme dieser Subspezies treten sehr selten als Ursache einer Infektion beim Menschen auf – es gibt aber Beschreibungen von z.T. tödlich verlaufenden Einzelerkrankungen bei Patienten mit eingeschränkter Immunfunktion.

Angesichts der beiden Milzbrandfälle bei Heroinkonsumenten aus dem Raum Regensburg, die wir letztes Jahr sowohl kulturell isolieren, mittels real-time PCR identifizieren und in enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (München) und dem RKI (Berlin) auch molekular feintypisieren konnten, wird der Ringversuch RV 542 (Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii) zukünftig um den Zielorganismus Bacillus anthracis erweitert, und im Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. als kombinierter PCR/NAT-Ringversuch „RV 542 Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii/B. anthracis“ gelistet. Aufgrund des großen Interesses an geeigneten PCR-Protokollen und der Verfügbarkeit von entsprechendem Positivkontrollmaterial, haben wir uns entschlossen, diesen kombinierten Ringversuch RV 542 als speziellen Service für die im L3-Bereich tätigen Kolleginnen und Kollegen, ohne Mehrkosten, im Vergleich zu dem vormaligen C. burnetii Ringversuch anzubieten. Bei der fachlichen Betreuung werden wir hier dankenswerterweise durch Herrn Kollegen PD Dr. Gregor Grass vom Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (München) unterstützt.

Nach erfolgreichem Verlauf der letzten beiden Ringversuchsrunden wurde der RV 560 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Pneumocystis jirovecii DNA nun in das reguläre Ringversuchsprogramm „Bakteriengenom-Nachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. aufgenommen.

Auf vielfachen Wunsch aus dem Kollegenkreis planen wir für den nächsten Aussendetermin im Mai 2014 einen Proberingversuch „RV 544 Differenzierter Nachweis von Carbapenemase Genen – PCR/NAT“. An der Ringversuchsleitung und Konzeption werden meine geschätzten Kollegen Herr Dr. Martin Kaase und Herr Prof. Dr. Sören Gatermann vom Nationalen Referenzzentrum für gramnegative Krankenhauserreger in Bochum maßgeblich beteiligt sein.

Im Rahmen des Proberingversuchs mit reduzierter Teilnahmegebühr werden ca. 40 Probensets zur Verfügung stehen, die nach dem Eingangsdatum der entsprechenden Anmeldungen zugeteilt werden. Bei Interesse also schnell über INSTAND e.V. anmelden!

Kolleginnen und Kollegen sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Chlamydia trachomatis (Probe # 1325304), sowie zwei der positiven Proben des RV 531 (# 1325311 und # 1325313), Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1325302 und # 1325304), Listeria spp. (Probe # 1325383), Mycoplasma pneumoniae (Probe # 1325413), Coxiella burnetii (Probe # 1325422), sowie Bacillus anthracis (Probe # 1325423). Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Angesichts der wachsenden Zahl an einzelnen und damit auch individuell zu diskutierenden Ringversuchen werde ich mich zukünftig bemühen, den Umfang dieser turnusmäßigen Ringversuchsauswertung in überschaubaren Grenzen zu halten und dabei dennoch versuchen, alle relevanten Informationen für die einzelnen Teilnehmer darzustellen. In diesem Zusammenhang freue ich mich natürlich auf jede Art von Rückmeldung aus dem Kreis der Ringversuchsteilnehmer und möchte ich mich gleichzeitig bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den vorhergegangenen Ringversuchsdiskussionen bedanken.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert). Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen und in den Tabellen 3 nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt. Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme auch immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit relativ geringen Menge an C. trachomatis (# 1325303, ~5x10³ IFU/mL und # 1325304, ~1x10³ IFU/mL), zwei Proben (# 1325302 und # 1325304) mit ca. 1x10³ CFU/mL an N. gonorrhoeae und eine Probe mit 10-fach höherer Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1325301; ~1 x10⁴ CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen darstellen (vgl. Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-4). Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger dargestellt (Tab. 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tab. 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in Tab. 5 und 7).

Auch wenn die beiden positiven Proben # 1325303 und # 1325304 des aktuellen Ringversuchs diesmal nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden waren, fanden sich unter den von insgesamt 147 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis lediglich 4 falsch-negative Ergebnisse. Da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den falschen Ergebnissen vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die Proben # 1325302 und 1325304 (N. gonorrhoeae; ca. 1x10³ CFU/mL) diesmal von 19 der insgesamt 144 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt. In der dritten GO-positiven Probe # 1315301 befand sich mit 1x10⁴ CFU/mL eine etwa 10-fach höhere Menge an N. gonorrhoeae-Zielorganismen, die diesmal erfreulicherweise von allen Teilnehmern einwandfrei nachgewiesen werden konnten.

Offenbar bereitet der spezifische Nachweis von Gonokokken-DNA in Probenmaterial, das neben Gonokokken zusätzlich auch noch C. trachomatis-Zielorganismen enthält, manchen Teilnehmern (bzw. den von diesen Teilnehmern eingesetzten Testssystemen) gewisse Schwierigkeiten: 12 falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1325304 gegenüber nur 7 falsch-negativen Ergebnissen bei Probe # 1325302. Für diesen Effekt, der in ähnlicher Konstellation ja bereits in einigen der vorhergehenden Ringversuchsrunden beobachtet wurde, hat der Ringversuchsleiter keine naheliegende Erklärung. Denkbar wäre natürlich eine gewisse Konkurrenzsituation der im Reaktionsgemisch der proprietären Testkits vorhandenen Primer-Moleküle. Zumindest aus wissenschaftlicher Sicht ist bei Chlamydien und Gonokokken aber davon auszugehen, dass die spezifische Amplifikation von Genomsegmenten dieser beiden unterschiedlichen Zielorganismen über unterschiedliche Primersets verläuft und seitens der Hersteller dafür keine Konsensus-Primersequenzen eingesetzt werden.

Da sich das hier beobachtete „Sensitivitätsproblem“ offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lässt und sich sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme zieht, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen 148 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um eine detaillierter Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen wurden diesmal zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 angefertigt. In Tab. 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in Tab. 6 und 7 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 3-4) nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Dies gilt im aktuellen Ringversuch vor allem für den einen (!) Teilnehmer mit dem neuen Cepheid Xpert CT/NG Testsystem und den drei Teilnehmern mit dem Artus CT/NG Testkits – auch wenn diese Teilnehmer mit ihren Testsystemen im aktuellen Ringversuch nahezu durchgehend 100% Richtigkeitsquoten erzielen konnten. Von einem der drei Teilnehmer mit Artus Testkit wurde hier ein falsch-negatives Ergebnis bei NG mitgeteilt und die Richtigkeitsquote sinkt dadurch von 100 auf 89%.

Das aktuelle Ringversuchsset enthielt diesmal zwei Proben mit relativ niedriger Menge an Zielorganismen (# 1325311 und # 1325313, ~1x10³ IFU/mL), eine Probe (# 1325314) mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis, sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1325312), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielten.

Wie Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden bei den drei positiven Proben von den insgesamt 102 Teilnehmern überwiegend korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Bei der etwas stärker positiven Probe # 1325314 fanden sich 2 falsch-negative Ergebnisse und bei den etwas schwächer positiven Proben # 1325311 und # 1325313 jeweils 2 bzw. 6 falsch-negative Ergebnisse auf den Reportformularen.

Bei der negativen Probe # 1325312, die ausschließlich nicht infizierte Humanzellen und Escherichia coli enthielt, sollten die falsch-positiven Ergebnisse bei den drei betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres DNA-Isolierungsprozesses bzw. des jeweiligen Chlamydia trachomatis-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben.

Von je einem Teilnehmer wurden die Ergebnisse bei den Proben # 1325312 und # 1325313 als „fraglich“ klassifiziert. Bei der Mitteilung von fraglichen Ergebnissen werden die entsprechenden Zertifikate nur dann erteilt, wenn diese Teilnehmer bei den übrigen 3 Proben des RV 531 korrekte Ergebnisse angegeben haben.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann, zumindest indirekt, erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme und der Probenabarbeitung angesehen werden.

Auch wenn mit 1x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme erreicht zu sein scheint, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität sowohl falsch-negative, als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Anmerkung: Wie bereits bei der Diskussion des RV 530 erwähnt, sollten in der Ergebnistabelle vor einer vorschnellen Bewertung einzelner kommerzieller Testsysteme erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen. Dies gilt im aktuellen Ringversuch vor allem für den einen (!) Teilnehmer mit dem TIB Molbiol LightMix CT/NG Testsystem und die vier Teilnehmer mit dem Abbott CT/NG Test – bei kleiner Teilnehmerzahl schlagen einzelne „Ausreißer“ prozentual natürlich stärker zu Buche und interessanterweise wurden mit beiden Testsystemen von anderen Teilnehmern bei vergleichbarer Fragestellung und CT Zielorganismen-Menge im RV 530 wesentlich bessere Ergebnisse erzielt.

Inhibitionskontrollen wurden von allen 102 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf hohem Niveau mit geringer statistischer Streuung.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal nur eine positive Probe mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (# 1325322 mit 1x10⁴ CFU/mL), sowie eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis als verwandte Spezies (# 1325324 mit 1x10⁴ CFU/mL). Die Proben # 1325321 und # 1325323 enthielten diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte auch diesmal wieder zu durchweg hohen Richtigkeitsquoten sowohl bei den positiven, als auch bei den negativen Proben. Lediglich von einem der insgesamt 116 Teilnehmer wurde ein falsch-negatives Ergebnisse für die positive Probe # 1325322 (B. pertussis, 1x10⁴ CFU/mL) mitgeteilt.

Bei der Probe # 1325324 mit 1x10⁴ CFU/mL an B. parapertussis wurden von 3 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse beobachtet. Hierbei handelt es sich offensichtlich um in-house PCR/NAT-Testsysteme mit unzureichender Speziesspezifität oder um laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung.

Inhibitionskontrollen wurden von 115 der insgesamt 116 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet. Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 54 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 10 Teilnehmern die Verwendung des Pertussis Toxin Gens und von 3 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gensegments als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-sensiblen H. pylori (# 1325332; ~10⁶ CFU/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1325333; ~10⁵ CFU/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1325334, ~10⁴ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1325331), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme und die relativ hohe Menge an Zielorganismen in zwei der drei positiven Proben (# 1325332 mit ~1x10⁶ CFU/mL und # 1325333 mit ~1x10⁵ CFU/mL) führte beim Nachweis von H. pylori-DNA im aktuellen Ringversuch erfreulicherweise zu Richtigkeitsquoten von 100%. Auch wenn diesmal keine „non-pylori“ Helicobacter-Spezies in einzelnen Proben des 4-er-Sets versandt wurden, deutet die Ergebniskonstellation dennoch auf eine gute analytische Spezifität und analytische Sensitivität der eingesetzten PCR-Testsysteme hin. Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 29 der insgesamt 35 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen). Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher drei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC positive Proben: mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1325341: E. coli, stx₁-, eae-, hlyA- und O157-positiv und # 1325343: E. coli, stx_2f- und eae-positiv) und mit ca. 1x10⁴ CFU/mL (# 1325342: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv). Die Probe # 1325344 enthielt einen E. coli K12-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

Mit Ausnahme der Probe #1325343 (stx_2f-positiven EHEC-Isolat) führte die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC bei den restlichen drei Proben durchweg zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde. Von 98 der insgesamt 104 Teilnehmer wurden durchweg korrekte Ergebnisse berichtet.

Für die 3 falsch-negativen PCR-Resultate bei dem stx-1-positiven EHEC-Isolat (# 1325341) sowie den 6 falsch-negativen PCR-Befunden bei dem stx-1- und stx-2-positiven EHEC-Isolat (# 1325342) gibt es keine naheliegenden Erklärungen – eventuell decken die eingesetzten Testkonzepte der entsprechenden Teilnehmer nicht das gesamte zu erwartende Spektrum an „üblichen“ stx-1- und stx-2-Genen ab (Gennachweis gilt als molekularer Marker für das Vorliegen von EHEC/STEC bzw. Shigella dysenteriae Typ 1 bei stx-1). Interessanterweise waren von den falsch-negativen EHEC-Ergebnissen bei den Proben # 1325341 und # 1315342 diesmal vorwiegend Anwender mit kommerziellen Testsystemen betroffen. Da jedoch bei genauerer Betrachtung der Ergebnislage von der überwiegenden Mehrzahl der Anwender solch vorkonfektionierter und standardisierter kommerzieller PCR-Kits richtige Befunde berichtet wurden, sollten entsprechende Defizite in Einzelfällen nicht so sehr bei den Konzepten oder dem Design der PCR-Testsysteme selbst, sondern vermutlich eher auf Seiten der betroffenen Anwender gesucht werden.

Aus wissenschaftlicher Sicht ist bei den üblicherweise eingesetzten PCR/NAT-Testsystemen eine „diagnostische Lücke“ allenfalls für stx-2f aufgrund der deutlich von den anderen Shiga-Toxin-Genen abweichenden Gensequenz zu erwarten. Dies wurde im aktuellen Ringversuch mit der Probe # 132343 eindrucksvoll bestätigt. Hier wurde lediglich von 25 der insgesamt 104 Teilnehmer ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von Shiga-Toxin-Genen berichtet. Auch wenn die humanpathogene Relevanz von stx_2f-positiven EHEC-Isolaten in der Fachwelt nach wie vor umstritten ist, soll hier an einem Beispiel aus der mikrobiologischen PCR-Routinediagnostik wieder einmal die überraschende Vielfalt an möglichen Genkonstellationen im Umfeld von EHEC-Isolaten aufgezeigt werden.

Der bisher einzige Nachweis eines stx-2f positiven EHEC-Isolates in unserem Hause erfolgte aus einer Lebensmittelprobe, als im Zuge des EHEC-Ausbruchsgeschehens im Jahre 2011 umfangreiche Screeninguntersuchungen aus Stuhl-, Umwelt- und Lebensmittelproben durchgeführt wurden. In diesem Fall passte der stx-2f-Nachweis übrigens „anamnestisch“ hervorragend zu den bekannten Übertragungsrouten (Blattsalat aus Gewächshaus, das aus ökologischen Gründen mit Regenwasser aus der Dachrinne bewässert wurde; das Dach dieses Gewächshauses war ein beliebter Rastplatz für die Bewohner von umliegenden Taubenkobeln …). Zur Thematik der „stx_2f-positiven E. coli-Isolate“ sind inzwischen auch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten veröffentlicht worden. Exemplarisch sei hier auf eine Publikation von Mitarbeitern des RKI in Wernigerode aus dem Jahre 2009 verwiesen [2].

Anmerkung an die Teilnehmer des aktuellen Ringversuchs: bitte keine Angst um die Zertifikate, denn diese Probe wurde als „edukative Probe“ deklariert und die entsprechenden Ergebnisse werden daher bei der offiziellen Bewertung zur Erteilung von Ringversuchszertifikaten außen vor gelassen.

Die Probe # 1325344 (E. coli K12-Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde von nahezu allen Teilnehmern korrekterweise als negativ befundet – sie führte lediglich bei 2 der insgesamt 104 Teilnehmer zu einem falsch-positiven Ergebnis.

Zudem wurden von 95 der insgesamt 104 Teilnehmer die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt.

Wie im Rahmen dieser Ringversuchsserie bereits mehrfach angesprochen, sind die starken Schwankungen vieler etablierter Testsysteme hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität bei der Erfassung von unterschiedlichen B. burgdorferi sensu lato-Genotypen bzw. auch OspA-Typen, die in Europa und Asien mit relativ hoher Inzidenz gefunden werden, nach wie vor ein zentrales Problem der NAT-gestützten Borrelien-Diagnostik. Diese Situation spiegelte sich auch in gewissem Umfang bei der Auswertung der bisherigen Ringversuche zum Nachweis von Borrelien-DNA wider. Im Umfeld des aktuellen Ringversuchs wollten wir uns bei der Auswahl von Art und Menge der Zielorganismen wieder auf die Abprüfung der analytischen Spezifität fokussieren.

Diesmal wurden bei der Konzeption des Ringversuchs unterschiedliche Borrelien-Spezies in 3 der 4 Einzelproben an die Teilnehmer versandt, und das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher eine Probe mit ca. 1x10⁴ Organismen/mL an Borrelia bissetii (# 1325351), eine Probe mit ca. 1x10⁴ Organismen/mL an Borrelia spielmanii (# 1325353), eine Probe mit ca. 1x10⁴ Organismen/mL an Borrelia afzelii (# 1325354) sowie eine Probe, die ausschließlich E. coli und humanes Zellmaterial enthielt (# 1325352).

Mittlerweile sind 18 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare Spezies beschrieben, die selbstverständlich auch entsprechende Unterschiede bei verschiedenen Zielgenen aufweisen. Von besonderem Interesse – da gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet – sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii und die aktuell als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Zur Häufigkeit der ebenfalls gesichert humanpathogenen B. spielmanii existieren bislang keine breit angelegten Studien. B. spielmanii wurde bislang nur bei Hautmanifestationen der Lyme-Borreliose beschrieben und scheint insgesamt nur selten an Erkrankungen beteiligt zu sein. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissetii, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft. Bezogen auf das OspA zeigt insbesondere B. garinii eine auffällige Heterogenität mit wenigstens 5 verschiedenen genetisch differenzierbaren Typen.

B. bissetii und B. spielmanii wurden bewusst als ungewöhnliche bzw. seltene B. burgdorferi-Spezies in den Ringversuch eingeschlossen. Beide Stämme wurden von Patienten isoliert. Der Patient mit der B. spielmanii-Infektion hatte im Vorfeld der aktuellen Infektion schon drei bei uns mittels Erregernachweis oder PCR gesicherte Borrelieninfektionen – jeweils durch exogene Re-Infektion, da es sich um unterscheidbare Stämme handelte. Der B. spielmanii-Stamm konnte nach verlängerter (10-wöchiger) Kultur aus einem Erythema migrans isoliert werden, welches sich im Bereich einer zuvor abgeheilten Acrodermatitis chronica atrophicans entwickelt hatte. Der Patient hatte bei Zustand nach mehreren Borrelien-Infektionen sehr hohe IgG-Antikörpertiter, und ein breites Spektrum erkannter Banden im IgG-Blot, was erneut zeigt, dass vorhandene Antikörper nicht zuverlässig gegen eine Re-Infektion schützen.

Der B. bissetii-Stamm konnte aus dem Liquor eines Patienten isoliert werden, der nur leichte Symptome einer Neuroborreliose präsentierte. Auch der Liquor zeigte nur schwache entzündliche Veränderungen. Diese Spezies konnte ansonsten bislang nur bei wenigen Patienten aus Slowenien angezüchtet werden, wobei diese Stämme nicht mehr existieren. Interessanterweise wurde diese Spezies in Europa bei verschiedenen Prävalenzstudien mit Zecken lediglich in einer Zecke gefunden, während in den USA diese Spezies nur in Zecken und bislang aus keinem Patient nachgewiesen werden konnte.

Borrelia afzelii in der positiven Probe # 1325354 (~1x10⁴ Organismen/mL) wurden bei 91 (95%) der insgesamt 96 Teilnehmer von den jeweils eingesetzten Borrelien-spezifischen PCR/NAT Testsystemen erfasst und korrekterweise als positiv befundet, lediglich 5 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis. Probe # 1325353 mit ca. 10⁴ B. spielmanii-Zielorgansimen/mL wurde von 92 (97%) der Teilnehmer als richtig positiv erkannt und 4 Teilnehmer berichteten ein falsch negatives Ergebnis. Immerhin noch 87 (90%) der Teilnehmer identifizierten die Probe # 1325351 mit ca. 10⁴ Borrelia bissetii-Zielorgansimen/mL als richtig positiv, während 7 Teilnehmer diese Probe mit der nur sehr selten anzutreffenden Borrelien-Spezies als falsch negativ beurteilten und 2 weitere Teilnehmer diese als fraglich klassifizierten.

Falsch-negative Ergebnisse insbesondere bei den beiden relativ stark positiven Proben mit B. spielmanii und B. afzelii sollte den entsprechenden Teilnehmern Anlass geben, ihre Testsysteme einschließlich der Aufarbeitung und DNA-Extraktion einer eingehenderen Prüfung zu unterziehen.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 43 der 96 Teilnehmer eingesetzt. Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität zwischen 95 und 100%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 93%) zu beobachten. Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden großteils mitgeführt und signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem der 96 Teilnehmer beobachtet.

Aufgrund zahlreicher Anfragen hier eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine sehr stark positive Probe # 1325361, die mit einer Menge von ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 3 versetzt war, sowie eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1325362, ca. 10⁴ CFU/mL) an Legionella pneumophila-Serogruppe 3. Die Probe # 1325363 des aktuellen Sets enthielt ca. 10⁶ IFU/mL an Chlamydia pneumoniae. Die „negative“ Probe # 1325364 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli. Letztere wurde erfreulicherweise von 83 der insgesamt 84 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Dies spricht wieder einmal für ein gutes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die relativ stark positive Probe # 1325361 mit ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila wurde diesmal von allen 84 Teilnehmern korrekterweise als positiv befundet. Die etwa 100-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 1325362 (ca. 10⁴ CFU/mL) konnte immerhin noch von 78 Teilnehmern mit ihren jeweiligen speziesspezifischen PCR-Testsystemen erfolgreich nachgewiesen werden.

Unter den 6 Teilnehmern mit falsch-negativem Ergebnis fanden sich überwiegend eigenentwickelte real-time PCR-Protokolle mit 16S rDNA, dem omp- oder dem mip-Gen als spezifische Zielsequenz, sowie ein nested Block-Cycler PCR-Protokoll zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte. Letzteres Testkonzept sollte über das große Amplifikationsvolumen und den nested-PCR-Schritt eigentlich empfindlich genug sein, um auch etwas geringere Mengen an L. pneumophila-Zielorganismen im Probenmaterial zuverlässig nachweisen zu können.

Probe # 1325363 enthielt diesmal eine nennenswerte Menge an Chlamydia pneumoniae mit ca. 1x10⁶ IFU/mL, deren DNA in den jeweiligen L. pneumophila-spezifischen PCR-Testsystemen aller 84 Teilnehmer keine Kreuzreaktionen und die damit verbundenen falsch-positiven Ergebnisse zeigte. Bei dem einzelnen falsch-positiven Ergebnis bei Probe # 1325364 (ausschließlich E. coli und humanes Zellmaterial) handelt es sich offenbar um ein sporadisches laborinternes Kontaminationsereignis bzw. Kreuzkontamination während der Probenextraktion und Abarbeitung.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben in einer Art von Verdünnungsreihe (siehe auch Tab. 1 in Anhang 1 [Anh. 1], S. 11): eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1325371; Salmonella enterica ser. Typhi, ca. 10⁶ CFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1325374; Salmonella enterica ser. Typhi, ca. 10⁵ CFU/mL), eine mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1325373; Salmonella enterica ser. Typhi, ca. 10⁴ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1325372), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Insgesamt betrachtet waren keine falsch-positiven Ergebnisse und lediglich zwei falsch-negative Ergebnisse bei den positiven Proben # 1325373 (ca. 10⁴ CFU/mL) und # 1325374 (ca. 10⁵ CFU/mL) zu beobachten. Im direkten Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden deutet dies auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin, denn unmittelbar nach der stark positiven Probe # 1325371 (ca. 10⁶ CFU/mL) folgte diesmal eine negative Probe, die von keinem der 11 Teilnehmer positiv getestet wurde. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Zusammenfassend wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 11 Teilnehmern durchgehend korrekte Ergebnisse bei der negativen Probe # 1325372, sowie bei der positiven Probe # 1325371 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen mitgeteilt. Lediglich die etwas schwächer positive Probe # 1325373 (Salmonella enterica ser. Typhi, ca. 10⁴ CFU/mL) wurden von je einem Teilnehmer falsch-negativ befundet. Die Richtigkeitsquoten lagen somit wieder erfreulich hoch.

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. Im aktuellen Ringversuch wurde hingegen eine Art Verdünnungsreihe von Listeria monocytogenes angefertigt, um primär die untere Nachweisgrenze der derzeit eingesetzten Testsysteme abzuprüfen. Probe # 1325381 enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 10⁵ CFU/mL), die auch von 23 der insgesamt 25 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1325382 enthielt mit ca. 10⁴ CFU/mL eine etwa zehnfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Lediglich 2 der 25 Teilnehmer berichteten hier ein negatives Ergebnis – vermutlich wurde in diesen Fällen ein Testsystem mit unzureichender analytischer Sensitivität verwendet.

Falsch-negative Ergebnisse bei den beiden relativ stark positiven Proben # 1325381 und # 1325382 sollten den entsprechenden Teilnehmern definitiv Anlass geben, ihre PCR/NAT-gestützten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme einschließlich der Probenaufarbeitung und DNA-Extraktion einer eingehenderen Prüfung zu unterziehen.

Mit ca. 10³ CFU/mL L. monocytogenes/mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1325383 diesmal eine sehr geringe Menge der entsprechenden Zielorganismen. Erfreulicherweise konnte selbst diese schwach-positive Probe noch von 23 der insgesamt 25 Teilnehmer als „positiv“ klassifiziert. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen wurden die mitgeteilten Ergebnisse bei der letztgenannten Probe diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) gekennzeichnet.

Da wir uns innerhalb dieses Ringversuchsprogramms gelegentlich auch mit einzelnen Proben an die derzeit technisch machbare untere Nachweisgrenze annähern wollen (Anmerkung: wir sind uns dabei sehr wohl bewusst, dass bei vielen Fragestellungen das „technisch machbare“ nicht unmittelbar gleichbedeutend mit dem „diagnostisch sinnvollen“ ist), bestand beim aktuellen Listerien-Ringversuch die diagnostische Herausforderung in der Abprüfung der analytischen Sensitivität individueller Testkonzepte. Der möglichst selektiven Detektion bzw. differenzierten Erfassung von non-monocytogenes Listerienspezies werden wir uns wieder in einigen der zukünftigen Ringversuchsrunden widmen.

Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit dem aktuellen Ringversuch auch wieder standardisierte Rückstellproben mit geringerer Menge an Zielorganismen zur Verfügung, die als untere Messlatte bezüglich der analytischen Sensitivität dienen können und direkt über den Ringversuchsleiter zu beziehen sind.

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Nach den zugegebenermaßen etwas umfangreichen und ausführlichen Diskussionen der Ergebniskonstellationen vorhergegangener MRSA Ringversuche kann die Auswertung des aktuellen Ringversuchs erfreulich kurz gehalten werden. Da wir diesmal, abgesehen von einer Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation die in der täglichen Praxis nicht gerade selten beobachtet wird), keine „interessanten“, „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 241 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1325391 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~10⁴ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~10⁴ CFU/mL), die Probe # 1325392 ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~1x10³ CFU/mL) und Probe # 1325393 eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (cMRSA; PVL-positiv; spa: t310; ~1x10⁴ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1325394, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der relativ stark positiven cMRSA Probe # 1325393 von allen 241 Teilnehmern durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Auch wenn sich in der zweiten MRSA-positiven Probe # 1325392 eine etwas geringere Menge an entsprechenden Zielorganismen befand, so ist die diesmal beobachtete Richtigkeitsquote von 99% als durchaus respektabel zu bezeichnen. Für diese Probe wurden von 237 der insgesamt 241 Teilnehmer korrekt positive Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 4 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen 4 Teilnehmern selbstentwickelte (in-house) PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10³ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1325392 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1325391 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 214 der insgesamt 241 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 11 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 6 dieser 11 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 16 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1325391 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 16 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!).

Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1325391 in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec-Kassette aufweist).

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1325394), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von einem der 241 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 200 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen, bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der zuletzt diskutierten Probe spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 57 der insgesamt 241 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diesmal sowohl die negativen, als auch die positiven Ergebnisse für die molekularbiologische PVL-Testung durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der nach wie vor hochaktuellen cMRSA- bzw. CA-MRSA- Problematik finden sich beispielsweise unter [3] oder [4]. Ein gut evaluiertes real-time PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in [5]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1325404; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁵ IFU/mL) und eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1325401; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁴ IFU/mL), eine Probe mit ca. ~1x10⁵ Genomkopien/mL an Mycoplasma pneumoniae (# 1325402), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1325403), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Wie bereits in den vorhergegangenen Ringversuchen zu beobachten war, so wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae-DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1325401 (ca. 10⁴ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Mit ca. 10⁵ IFU/mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1325404 diesmal eine relativ hohe Menge an C. pneumoniae-Zielorganismen. Erfreulicherweise wurde diese Probe ebenfalls von 93 der insgesamt 94 Teilnehmer als (richtig-) positiv befundet.

Erfreulicherweise wurden für die beiden Proben ohne Zielorganismen # 1325402 (Mycoplasma pneumoniae) und # 1325403 (humanes Zellmaterial und nennenswerte Menge an E. coli) ebenfalls von 93 der insgesamt 94 Teilnehmer richtig negative Ergebnisse berichtet. Dies unterstreicht wieder einmal aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Bei den beiden isoliert falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von Mykoplasmen oder E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern des vergangenen Ringversuchs hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten ;-)

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], 16) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1325412 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL) und Probe # 1325413 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁴ Genomkopien/mL). Um im Rahmen der Möglichkeiten dieses Ringversuchskonzepts auch die Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, enthielten Probe # 1325411 (Mycoplasma genitalium; ~1x10⁴ Genomkopien/mL) und Probe # 1325414 (Mycoplasma genitalium; ~1x10⁵ Genomkopien/mL) diesmal nennenswerte Mengen an einer zu dem Zielorganismus verwandter Mykoplasmen-Spezies.

Insgesamt betrachtet wurden von den Teilnehmern im Rahmen der aktuellen Ringversuchsrunde zumindest für 3 der insgesamt 4 Proben wieder erfreulich hohe Richtigkeitsquoten erzielt. Mit Ausnahme eines Teilnehmers konnten diesmal alle der insgesamt 104 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1325412 problemlos und zuverlässig nachweisen. Der zuverlässige Nachweis von M. pneumoniae-DNA in der etwas schwächer positiven Probe # 1325413 gelang immerhin noch 94 von allen 104 Teilnehmern. Zum Vergleich sei hier kurz auf den vorhergehenden Ringversuch Mai 2013 verwiesen: hier konnten ebenfalls 109 von 119 Teilnehmern die M. pneumoniae-DNA in einer vergleichbar konzentrierten positiven Probe mit ca. 10⁴ Genomkopien/mL nachweisen.

Erfreulicherweise wurden für die beiden „negativen“ Proben des aktuellen Probensets, die diesmal jedoch mit nennenswerten Mengen einer mit dem Zielorganismus verwandten Bakterienspezies versetzt waren, ebenfalls sehr hohe Richtigkeitsquoten beobachtet. Wie in Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) dargestellt, berichteten lediglich je 4 der insgesamt 104 Teilnehmer bei den Proben # 1325411 (Mycoplasma genitalium; ca. 10⁴ Genomkopien/mL) und # 1325414 (M. genitalium; ca. 10⁵ Genomkopien/mL) falsch-positive Ergebnisse. Diese Ergebniskonstellation in einem breiten Teilnehmerfeld mit unterschiedlichsten Testsystemen und PCR-Protokollen belegt eine relativ hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA.

Bei den jeweils 4 isoliert falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Eventuelle Kreuzreaktivitäten der M. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von anderen Mykoplasmen-Spezies sollten von den betroffenen Teilnehmern abgeprüft und die entsprechenden Testkonzepte ggf. nachgebessert werden.

Insgesamt deutet diese Ergebnislage auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin.

Die diagnostische Performance eines etablierten in-house-Protokolls und ausgewählter kommerzieller NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA wurde im Sollwertlabor für RV 541 (Prof. Jacobs und Dr. Dumke, Dresden) im Rahmen einer systematischen Studie untersucht. Auch hier erwiesen sich diese Testsysteme als spezifisch, sensitiv und auch zuverlässig bezüglich der Erfassung aller relevanten M. pneumoniae-Subtypen und Varianten [6].

Dieser seit kurzem in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1325422 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1325424), zwei Proben mit 10-fach unterschiedlicher Menge an Bacillus anthracis-DNA (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1325423 und ~5x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1325422), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1325421), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in den Tabellen 2 und 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) sowie für Bacillus anthracis in den Tabellen 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 18).

Erfreulicherweise kann die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs sehr einfach dargestellt werden. Sowohl die etwas stärker positive Probe # 1325424 mit ca. 10⁴ Genomkopien C. burnetii/mL als auch die zweite positive Probe # 1325422 des Probesets mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an C. burnetii (ca. 10³ Genomkopien/mL) wurde diesmal von allen der insgesamt 20 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus den vorherigen Ringversuchen – Schwierigkeiten beim zuverlässigen bzw. reproduzierbaren Nachweis von C. burnetii-DNA traten damals erst bei Proben mit weniger als ca. 10³ Genomkopien/mL auf. Diese untere Nachweisgrenze bestätigt sich offenbar auch im aktuellen Ringversuch.

Bei den Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1325421 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1325423 (ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL Bacillus anthracis-DNA und eine Suspension aus humanen Zellen) wurden von allen 20 Teilnehmern ebenfalls korrekt negative Ergebnisse berichtet. Siebzehn der insgesamt 20 Teilnehmer gaben die Verwendung eines eigenentwickelten (in-house) PCR-Testkonzepts an; bei drei dieser Teilnehmer war explizit das „Transposase Gen (IS1111)“ als Zielsequenz vermerkt.

Die Ergebnislage des im Rahmen der aktuellen Ringversuchsrunde neu eingeführten Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt und diskutiert.

Alle der 14 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten Bacillus anthracis-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die beiden positiven Proben mit ca. 5x10⁴ Genomkopien/mL (# 1325422) und mit ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL (# 1325423) an Bacillus anthracis-DNA erfolgreich nachweisen.

Ebenfalls von allen der 14 Teilnehmer wurden korrekt negative Ergebnisse für die Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1325421 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1325424 (nur Coxiella burnetii mit ca. 10⁴ Genomkopien/mL und eine Suspension aus humanen Zellen) beobachtet. Insgesamt doch wohl eine sehr erfreuliche Gesamtsituation.

Zudem stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Dieser ebenfalls seit kurzem neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1325431 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁶ CFU/mL), Probe # 1325433 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1325434 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an F. tularensis spp. novicida. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (#1325432), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Ähnlich wie bei den beiden zuvor diskutierten Ringversuchen haben auch hier alle der 15 Teilnehmer die relativ stark positive F. tularensis spp. holarctica-Probe # 1325431 sowie die etwa 10-fach geringer konzentrierte Probe # 1325433 mit ihren NAT-gestützten Testsystemen korrekt identifiziert. Lediglich von einem der 15 Teilnehmer wurde bei der Probe # 1325434 (F. tularensis spp. novicida; ca. ~1x10⁵ CFU/mL) ein negatives Ergebnis berichtet. Dieses Ergebnis ist aber nicht zwangsläufig als falsch negativ zu bewerten. In diesem Ringversuch wurde erstmalig auch DNA der „4.“ Subspezies, von F. tularensis (spp. novicida) eingesetzt. Stämme dieser Subspezies treten sehr selten als Ursache einer Infektion beim Menschen auf. Es gibt aber Beschreibungen von z.T. tödlich verlaufenden Einzelerkrankungen bei Patienten mit eingeschränkter Immunfunktion. Dieser Erregertyp verursacht allerdings keine „typische“ Tularämie bei immunkompetenten Menschen. Infizierte Personen weisen in herkömmlichen serologischen Assays auch keine Antikörper gegen das LPS von F. tularensis (spp. holarctica, tularensis oder mediasiatica) auf. Unter diesem Gesichtspunkt könnte man eine positive NAT-Reaktion in dieser Probe auch als falsch positives Ergebnis werten (fehlende Spezifität).

Die Taxonomie der Gattung Francisella ist aktuell relevanten Änderungen unterworfen. Zusätzlich umfasst die Gattung mindestens zwei weitere Spezies (F. philomiragia, F. hispaniensis), die ebenfalls als humanpathogen gelten. Im Bereich der Veterinärmedizin kommen zwei weitere pathogene Spezies hinzu. Mindestens einer der von den Ringversuchsteilnehmern verwendeten Assays detektiert alle diese Spezies. Je nach klinischer Fragestellung kann sich dies positiv oder negativ auf die Befundbeurteilung auswirken. Wir haben diese Subspezies im gegenwärtigen Ringversuch eingeschlossen, um alle Teilnehmer auf diese Problematik hinzuweisen. Seit kurzem stehen die kompletten Genomdaten aller Spezies und Subspezies in den gängigen Datenbanken (e.g. NCBI) zur Verfügung, so dass anhand dieser Daten die Spezifität der eingesetzten Primer und Sonden auch für jeden in-house-Test überprüft werden kann.

Da auch der Nachweis der Subspezies F. tularensis spp. tularensis (Typ A nach Jellison) eine besondere klinische und arbeitsmedizinische Bedeutung hat, ist angedacht, in zukünftigen Ringversuchen auch DNA dieser Subspezies einzusetzen, um den Teilnehmern zu ermöglichen, die Sensitivität und Spezifität ihrer Assays in Bezug auf eine Subspeziesbestimmung zu überprüfen. Für den klinischen Alltag gilt bis dahin, dass jede positive NAT-Reaktion in einer klinischen Probe kritisch hinterfragt und ggf. einer weiteren Untersuchung (Sub-Typisierung) zugeführt werden sollte.

Auch wenn die Anzahl der teilnehmenden Laboratorien bei der aktuellen Ringversuchsrunde noch nicht sehr hoch ist, so kann in der Zusammenschau der bisher durchgeführten Ringversuche festgestellt werden, dass die untere Nachweisgrenze der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von F. tularensis-DNA unterhalb einer Menge von ca. 10⁴ Organismen/mL Probenmaterial liegen dürfte.

Die ersten Ringversuche RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ sind bewusst so konzipiert, dass sie der RV-Leitung einen Überblick über die aktuell verfügbaren NAT-gestützten Methoden und Protokolle zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien verschaffen. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben erneut zwei positive Proben (siehe auch Tab. 1 in Anhang 1 [Anh. 1], S. 20): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1325601; Pneumocystis jirovecii, ca. 3x10⁵ Genomkopien/mL), eine mit etwas geringerer Menge (# 1325603; Pneumocystis jirovecii, ca. 9x10⁴ Genomkopien/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1325602 und # 1325604), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielten.

Erfreulicherweise hat sich auch in der aktuellen Ringversuchsrunde die überaus gute Ergebnislage des im Mai 2013 erstmals regulär durchgeführten Ringversuchs RV 560 bestätigt.

Sowohl die etwas stärker positive Probe # 1325601 mit ca. 3x10⁵ Genomkopien/mL sowie die etwas schwächer positive Probe # 1325603 mit ca. 9x10⁴ Genomkopien/mL wurde von nahezu allen der insgesamt 59 Teilnehmer als positiv befundet.

Lediglich von einem der 59 Teilnehmer wurde bei der etwas stärker positiven Probe # 1325601 ein falsch-negatives Ergebnis beobachtet – wobei dieser Teilnehmer die etwas schwächer positive Probe # 1325603 wieder korrekterweise als Pneumocystis jirovecii-positiv berichtete (?). Angesichts der mit mehr als 10⁵ Genomkopien/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollte das isoliert beobachtete falsch-negative Ergebnis dem betroffenen Ringversuchsteilnehmer Anlass zur Überprüfung und Optimierung seines entsprechenden NAT-gestützten Testsystems geben.

Bei den beiden Proben ohne Zielorganismen (# 1325602 und # 1325604), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet. Dies spricht unter anderem für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Nicht zuletzt aufgrund dieser erfreulichen Ergebnislage werden sich in den zukünftig ausgesandten 4-er-Sets auch immer positive Proben befinden, die relativ geringe Genommengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.