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104th DOG Annual Meeting

21. - 24.09.2006, Berlin

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Kryokonservierte Amnionmembran für die Rekonstruktion der Augenoberfläche produziert keine bioaktive Substanzen

Cryopreserved amniotic membrane for ocular surface reconstruction does not actively produce bioactive substances

Meeting Abstract

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  • F. R. Wettey - Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen
  • D. Lonskowski - Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen
  • M. Pauklin - Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen
  • K.-P. Steuhl - Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen
  • D. Meller - Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen

Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft e.V.. 104. Jahrestagung der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft (DOG). Berlin, 21.-24.09.2006. Düsseldorf, Köln: German Medical Science; 2006. Doc06dogP097

The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.egms.de/en/meetings/dog2006/06dog619.shtml

Published: September 18, 2006

© 2006 Wettey et al.
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Ziel

Es wurde oft berichtet, dass kryokonservierte Amnionmembran (kryo-AM) verschiedene Faktoren auf RNA Ebene exprimiert und sogar lösliche Proteine sezernieren soll, die wundheilungsfördernd bei der Rekonstruktion der Augenoberfläche wirken. Wir möchten klarstellen, dass AM nach Kryokonservierung devitalisiert ist und daher solche Faktoren aktiv nicht exprimieren und sezernieren kann.

Methode

Wir haben einen Zell-Vitalitätsassay für frische sowie kryo-AM benutzt, um mit Plasmamembran-inpermeablen Propidiumiodid tote Zellen zu detektieren und mit Membran-permeablen Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) lebende Zellen (Calcein-positiv) sowie tote Zellen (Calcein-negativ) zu identifizieren. Als positive und negative Kontrollen für die Färbung haben wir lebende, Paraformaldehyd-fixierte (tote) sowie semi-intakte 3T3-Zellkulturen, welche kurz mit 0.01% Saponin permeabilisiert wurden, verwendet. Zusätzlich haben wir die Gesamt-RNA, die von den AM Proben extrahiert wurde, analysiert.

Ergebnisse

Im Gegensatz zu frischer AM waren die Zellen der kryo-AM (50% DMEN/50% Glycerol) eindeutig devitalisiert. Alle Zellen auf kryo-AM waren mit Propidiumiodid gefärbt. Calcein-AM, welches in lebenden Zellen nach enzymatischer Hydrolisierung fluoresziert und dann im Zytoplasma zurückgehalten wird, war homogen in lebenden Zellen verteilt, was nicht für kryo-AM zutraf. Die lebenden, fixierten und permeabilisierten 3T3 Zellen bestätigten, dass der Assay wie erwartet funktionierte. Im Einklang mit diesen Resultaten konnten wir mit verschiedenen Extraktionsmethoden intakte RNA von guter Qualität aus frischer AM isolieren, jedoch nur stark degradierte RNA aus kyo-AM und gar keine RNA aus kryo-AM nach länger Inkubation in Zellkulturmedium.

Schlussfolgerungen

Weil die Zellen der kryo-AM nach dem Auftauen eindeutig devitalisiert, keine enzymatische Aktivität detektierbar und keine intakte RNA extrahierbar war, ist es generell unmöglich, dass dieses Material aktiv irgendwelche bioaktive Substanzen produzieren oder gar sezernieren kann. Falls allerdings solche aus kryo-AM freigesetzt werden, so sind diese vermutlich Zellreste von geschädigten, toten Zellen. Da diese Faktoren in der Praxis ausgewaschen werden, ist ein längerfristiger Nutzen solch löslicher Zerfallsprodukte fraglich, d. h. höchstwahrscheinlich zeitlich begrenzt. Deshalb empfehlen wir in Fällen, wo die AM als Patch in der Rekonstruktion der Augenoberfläche eingesetzt wird, diese regelmäßig in kurzen Zeitabständen zu erneuern.