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Einleitung: Histologische und immunhistochemische Analysen sind zur Beurteilung der osteogenen Differenzierung unverzichtbar. Dabei müssen in der Regel 3 unterschiedliche Marker untersucht werden. Bei herkömmlichen Verfahren wird für jeden Marker ein eigener Probenansatz benötigt. Diese Ansätze werden zwar gleich behandelt, sind aber nie in Bezug auf die enthaltenen Zellen identisch und deshalb nur eingeschränkt aussagekräftig.

Methode: Aus Hüftkopfspongiosa von 5 Spendern wurden primäre humane Knochenzellen gewonnen und separat kultiviert. Nach Fixierung und Lufttrocknung erfolgte die Färbung in 3 Schritten: 1. Färbung der Adipozyten mit Sudan III, 2. Darstellung der Alkalischen Phosphatase (AP) mit NBT/BCIP, 3. Färbung von Kollagen mit Sirius Rot. Als Referenz wurden sämtliche Teilschritte auch einzeln durchgeführt. Aus jeder Knochenzellkultur wurden 10 Ansätze für die Dreifachfärbung angefertigt. Die Ansätze wurden fotodokumentiert, semiquantitativ ausgewertet und mit den jeweiligen Referenzansätzen verglichen.

Ergebnis: In ein und dem selben Probenansatz erscheinen AP-positive Zellen dunkelblau, Kollagen-positive Matrix matt rosa und Fett-positive Zellen leuchtend rot (siehe Abbildung 1 [Abb. 1]). Dabei entsprach die jeweilige Intensität der Marker in den Dreifachfärbungen in allen Ansätzen der Expression in den Referenzfärbungen. Wurden die Ergebnisse der 5 unterschiedlichen Knochenzellkulturen verglichen, zeigten sich deutliche Unterschiede bezüglich der Expression von AP, Kollagen und Fett.

Diskussion: Die Qualität von Knochenzellen entscheidet maßgeblich über den Erfolg von osteogenen Tissue Engineering Verfahren. Die vorliegende Untersuchung zeigt erstmals die erfolgreiche Dreifachfärbung von Knochenzellen und mesenchymalen Stammzellen für AP, Kollagen und Fett. Anhand der 3 gleichzeitig untersuchten Marker lässt sich eine zuverlässige Aussage über den Differenzierungsgrad von Knochenzellen treffen. Es handelt sich um eine aussagekräftige, reproduzierbare, einfach durchführbare und gut dokumentierbare Methode zur Beurteilung von Zellen beim Tissue Engineering von Knochengewebe.