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Fragestellung: Der Transkriptionsfakor Sox9 spielt eine Schlüsselrolle in der frühen Chondrogenese. Trotz dieser wichtigen Funktion als Hauptregulator der Chondrogenese, ist wenig über die Sox9 Genregulation bekannt, ob Redundanzen zwischen den Genen der Sox Familie bestehen, welchen Einfluss der Expressionslevel besitzt und in welchem Maße Sox9 direkt oder indirekt an differenzierungsstadienspezifischen Prozessen beteiligt ist.

Wir demonstrieren mittels RNA Interferenz (RNAi) die Effekte eines Sox9 Gen-knockdows auf die Genexpression ausgewählter Zielgene in Mesenchymalen Stammzellen der Ratte und verfolgen nach der Etablierung eines erfolgreichen knockdown Protokolls einen proteomischen Ansatz zur Identifizierung unbekannter Signalfaktoren und Proteine, die an der Chondrogenese beteiligt sind.

Methodik: Zellen wurden im Monolayer bis zu einer Konfluenz von 45% kultiviert und anschließend mit Sox9 shRNA unter Verwendung eines viralen Transduktionssystems (Clontech TM pSIREN) transduziert. Die Transduktionseffizienz wurde nach 48-72 Stunden sowohl durch die Analyse des Genexpressionslevels von Sox9 normalisiert zu endogenem ß-Actin mittels quantitative PCR als auch auf Proteinebene durch Western Blotting mit Sox9 spezifischen Antikörpern bestimmt. Zellysate von Kontroll- und Sox9 knockdown Zellen werden in einem proteomischen Ansatz mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert.

Ergebnisse: Durch virale Transduktion von Sox9 shRNA konnte ein 50% knockdown der Sox9 Genexpression in primären Mesenchymalen Stammzellen der Ratte erreicht werden. Eine um 50% verminderte Proteinexpression von Sox9 bestätigte den knockdown Effekt, während ß-Actin unbeeinflusst bleibt und somit die Spezifität des Sox9 knockdowns untermauert. Während der Sox9 knockdown keinen Einfluss auf die Genexpression weiterer Sox Gene, Sox4 und Sox6, sowie die Transkriptionsfaktoren Tbox2 und Cbfa hat, konnten wir eine verminderte Genexpression des VEGFR2 sowie eine erhöhte Genexpression von Integrin alpha 11 beobachten.

Schlussfolgerung: In der Vorliegenden in vitro Gen-knockdown Studie demonstrieren wir, dass die Sox9 Expression in primären Mesenchymalen Stammzellen mittels eines Plasmid basierenden Gen-Transduktionssystems um 50% vermindert werden kann. Genexpressionsanalysen zeigen eine Regulation des VEGFR2 und des Integrin alpha 11 Gens. Es ist höchstwahrscheinlich, das zukünftige Affymetrix DNA microarray- und Proteomics Analysen an primären Sox9 knockdown Zellen die Identifizierung neuer Signalfaktoren, redundanter und unbekanntere Gene die an der Chondrogenese und dem Erhalt eines stabilen chondrogenen Phänotyps beteiligt sind, ermöglichen werden.