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Chondrogenese und Proliferation von hMSCs wird durch rAAV-vermittelte Überexpression von humanem FGF-2 stimuliert
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Autoren
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M. Cucchiarini
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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S. Schetting
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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A. Weimer
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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C. Ma
- Harvard Institutes of Medicine, Harvard University, Boston, United States of America
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E. Terwilliger
- Harvard Institutes of Medicine, Harvard University, Boston, United States of America
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S. Grässel
- Klinik & Poliklinik f. Orthopädie d. Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, Bad Abbach, Germany
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D.-M. Kohn
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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H. Madry
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
| Veröffentlicht: | 16. Oktober 2008 |
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Gliederung
Text
Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) könnten Kandidatengene zur Verbesserung der Knorpelreparatur überexprimieren. Wir untersuchten die Hypothese, daß eine rAAV-vermittelte Überexpression von humanem Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (hFGF-2) die Chondrogenese und Proliferation von hMSC stimuliert.
Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase (β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ), Red Fluorescent Protein (RFP) (rAAV-RFP), Luziferase (rAAV-luc) und hFGF-2 (rAAV-hFGF-2). MSC wurden aus dem Knochenmark von nichtarthrotischen Patienten isoliert. Transduzierte Zellen (Passage 1-2) wurden für 21 Tage in Monolayer oder in Aggregatkultur (100 μl rAAV/2 x 105 Zellen) in definiertem Medium kultiviert. Transgenexpression wurde mittels X-Gal-Staining, Live-Fluoreszenz, Luc-Assay, FGF-2-ELISA, Immunfärbungen (Typ-II- und Typ-X-Kollagen, Runx-2, Sox9) bestimmt. Paraffinschnitte wurden mit Toluidinblau and Alizarinrot gefärbt. Der DNS-Gehalt wurde fluorimetrisch, der Proteoglykan-Gehalt durch DMMB, der Typ-II-Kollagengehalt durch ELISA ermittelt. Morphometrische Messungen wurden an 3 standardisierten Stellen der Proben durchgeführt. Daten wurden geblindet von zwei individuellen Personen erhoben. Jede Kondition (n=3) wurde in zwei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Ergebnisse: In der Monolayerkultur lag die maximale FGF-2-Konzentration bei 350,2 ± 2,5 pg/ml/24h in rAAV-hFGF-2-transduzierten Zellen (rAAV-lacZ: 0,01 pg/ml/24h). Die Luziferase-Aktivität war mit 16,3 ± 0,6 RLU/mg Gesamtprotein nach 21 Tagen in rAAV-luc-transduzierten Zellen signifikant im Vergleich mit rAAV-lacZ-transduzierten Zellen erhöht (0,2 ± 0,1 RLU/mg Gesamtprotein). In Aggregatkultur war die maximale FGF-2-Konzentration 375,1 ± 1,6 pg/ml/24 h (rAAV-lacZ-transduzierte Kontrollaggregate: 1,51 ± 0,4 pg/ml/24 h). Chondrogene Differenzierung lag in beiden Gruppen nach 21 Tagen vor (Färbung mit Toluidinblau sowie Typ-II-Kollagen- und Sox9-Immunreaktivität). Kein signifikanter Unterschied zeigte sich im Proteoglykan-Gehalt (0,80 ± 0,10 versus 0,77 ± 0,05 ng/mg Gesamtprotein) und im Typ-II-Kollagen-Gehalt (0,023 ± 0,005 versus 0,020 ± 0,010 ng/mg Gesamtprotein) zwischen den Gruppen. Die Durchmesser (856 ± 30 versus 538 ± 36 µm), DNS-Gehalt (1,039 ± 0,005 versus 0,942 ± 0,009 ng/mg Gesamtprotein) und die Zellzahl (862 ± 14 versus 435 ± 12 Zellen/mm2) der mit rAAV-hFGF-2 behandelten Aggregaten war jeweils signifikant höher als der von Kontroll-Aggregaten (P 0.001).
Schlussfolgerungen: Humaner FGF-2 kann in hMSCs durch rAAV sowohl in Monolayer als auch in Aggregatkultur überexprimiert werden. Die Chondrogenese und Zellproliferation werden dadurch in dreidimensionaler Kultur stimuliert. Diese Ergebnisse könnten zur Verbesserung bestehender hMSC-basierter, markraumeröffnender Verfahren verwendet werden.
