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Fragestellung: Voraussetzung einer therapeutischen Nutzung mesenchymaler Stammzellen für die Frakturheilung ist deren in vitro-Expansion und anschließende Transplantation unter Verwendung geeigneter Träger-Biomaterialien. Typischerweise gelangen so transplantierte Stammzellen in ein Mikromilieu, das durch Leukozytenfaktoren (freigesetzt nach Adhärenz der Leukozyten an die Biomaterialmatrix bzw. induziert durch das Gewebetrauma) charakterisiert ist. Ziel der Studie war es, den Einfluss konditionierter Leukozytenmedien nach standardisierter Zellstimulation auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen zu analysieren.

Methodik: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC, Cambrex Bio Science, 3.-6. Passage) wurden in RPMI1640-Zellkulturmedium (10% FCS, 4mM Glutamin) in 6-Loch-Zellkulturplatten kultiviert. Aus Vollblut isolierte periphere mononukleäre Zellen (PBMC) und neutrophile Granulozyten (PMN) wurden mit Lipopolysaccharid (LPS, O55:B5) bzw. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) für 24h in RPMI1640/FCS stimuliert und der zellfreie Überstand (konditioniertes Medium) wurde auf hMSC transferiert. Zur Analyse der Rolle von TGF-ß wurden zusätzlich konditionierte Medien mit TGFß-bindenden Molekülen (anti-TGFß, Decorin oder Suramin) supplementiert. Die osteogene Differenzierung wurde nach 3 Wochen mittels Alizarin-Färbung und Quantifizierung der bone-nodule Anzahl bestimmt. Zellepitope auf hMSC wurden mittels Durchflusscytometrie und freigesetzte Cytokine mittels ELISA quantifiziert.

Ergebnisse: Konditionierte Medien nach LPS-Stimulation der Leukozyten (PMN, PBMC) induzierten die Bildung von bone nodules mit charakteristischer Mineralisierung. Konditionierte Medien nach TSST-1-Stimulation von PBMC führten zu keiner Bildung von bone-nodules. Die eingesetzten Zellstimuli allein hatten keinen Einfluss auf die osteogene Differenzierung der hMSC. Die Stimulation von hMSC mit LPS führte weder zur Zellproliferation noch zur Cytokinsynthese (IL-11). hMSC exprimierten zwar den LPS-Rezeptor Toll-like Rezeptor 4 (TLR 4), aber nicht CD14. TGFß hatte keinen Einfluss auf die osteogene Differenzierung von hMSC in dem Modell. Die Analyse von Cytokinen in den konditionierten Medien mittels Protein-Array (Proteome Profiler) oder ELISA ergab das typische Muster myeloider Cytokine (IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF) und Chemokine (GRO-alpha und MIP-1ß), während osteotrophe Lymphokine wie IL-17 nicht nachgewiesen wurden.

Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse weisen auf neue leukozytäre osteogene Faktoren und belegen die wichtige Rolle aktivierter myeloider Leukozyten im Rahmen physiologischer und heterotoper Ossifikationen.