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Etablierung von klonalen, immortalisierten humanen mesenchymalen Stammzelllinien durch Überexpression von hTERT mit Hilfe von Lentiviren
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Autoren
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M. Schieker
- Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
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Z. Yin
- First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Department of Orthopaedics, Xi'an, Shaanxi, China
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O. Rossmann
- Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
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W. Mutschler
- Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
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W. Böcker
- Chirurgische Klinik - Innenstadt, LMU München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
| Veröffentlicht: | 9. Oktober 2007 |
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Gliederung
Text
Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) können potentiell therapeutisch für den Knochenersatz eingesetzt werden. Obwohl hMSCs ein hohes Proliferationspotential besitzen, kommt es in vitro immer zu einem alterungsbedingten Wachtumsstop mit phänotypischen Veränderungen, was die zu verwendende Zellzahl limitiert. In dieser Studie haben wir untersucht, ob durch die ektope Überexpression der humanen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) mittels lentiviralem System die Lebensspanne verlängert werden kann, ohne eine maligne Transformation zu erzeugen.
Methodik: Wir haben hTERT-transduzierte hMSCs (hTERT-hMSCs) mit Hilfe des lentiviralen Gentransfers etabliert. Es wurden Zell-Klone durch Einzelzellisolation isoliert und vermehrt. Die ektope Überexpression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt und die Zellalterung durch eine β-gal-Färbung untersucht. Das Differenzierungspotential wurde durch von Kossa-Färbung für osteogene, Oil red O-Färbung für adipogene, und Kollagen II-Färbung für chondrogene Differenzierung bestätigt. Eine mögliche maligne Transformation wurde durch Bestimmung der Kontaktinhibition und Kolonieformation im "soft agar assay" untersucht.
Ergebnisse: Von den 22 isolierten hTERT-hMSC-Klonen zeigten 3 Klone eine persistierende Proliferation mit bis zu 120 Populationsverdoppelungen (PDs), während untransduzierte hMSCs nach 25 PDs einen altersbedingten Wachstumsstop zeigten. Alle hMSC Klone hatten eine starke ektope hTERT-Überexpression, während untransduzierte hMSCs keine messbare hTERT-Expression zeigten. Die alterungsassoziierte β-gal-Färbung war negativ in hTERT-hMSCs, aber positiv in untransduzierten hMSCs. Morphologisch zeigten die transduzierten hTERT-hMSCs ebenfalls keine Alterungserscheinungen, und behielten die Fähigkeiten zur Differenzierung in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Alle 3 hTERT-hMSC-Klone zeigten im "soft agar assay" in vitro keine Zeichen einer malignen Transformation.
Schlussfolgerungen: Wir konnten erstmals mittels lentiviralem Gentransfer eine humane mesenchymale Stammzelllinie etablieren, welche den Phänotyp von Stammzellen behielt ohne eine maligne Entartung zu entwickeln. Dies erlaubt in Zukunft Untersuchungen mit beliebig großen Mengen an isogenetischen humanen mesenchymalen Stammzellen.
