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Direkter, rAAV-vermittelter Gentransfer von FGF-2 stimuliert die Zellproliferation in humanem normalen und arthrotischem Gelenkknorpel
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Autoren
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H. Madry
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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T. Thurn
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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E. Terwilliger
- Harvard Institutes of Medicine, Harvard University, Boston, United States of America
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D. Kohn
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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M. Cucchiarini
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
| Veröffentlicht: | 28. September 2006 |
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Gliederung
Text
Einleitung: Gentransfer von therapeutischen Kandidaten könnte die Reparatur von humanem Gelenkknorpel stimulieren. Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (FGF-2) ist ein chondrogener Wachstumsfaktor welcher vorwiegend mitogen auf Chondrozyten wirkt. Wir testeten die Hypothese daß direkter Gentransfer von FGF-2 durch einen rekombinanten adeno-assozierten viralen Vektor (rAAV) die Zellproliferation in humanen normalen und arthrotischen Gelenkknorpelexplantaten moduliert.
Methoden: Eine humane FGF-2 cDNS wurde in rAAV-lacZ anstelle von lacZ kloniert um rAAV-hFGF-2 zu erzeugen. Humane normale und arthrotische (Mankin score: 7-9) Gelenkknorpelexplantate wurden mit rAAV transduziert und für 21 Tage in vitro kultiviert. Auswertungen basierten auf morphometrischen Messungen der Explantate sowie biochemischer Bestimmung der DNS-Menge (Hoechst 33258) und Proteoglykane (DMMB) der Explantate. Typ-II-Kollagen wurde durch ELISA bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte durch den t-Test und den Mann-Whitney Rank Sum Test.
Ergebnisse: Die Transgenexpression war in allen Knorpelschichten nachweisbar und stieg dosisabhängig an. Nach Transduktion mit rAAV-FGF-2 lag die FGF-2 Sekretion in normalem Gelenkknorpel bei 768 pg/ml (20 ul Vektor) und 1,810 pg/ml (50 ul Vektor). Ähnliche Daten wurden mit arthrotischem Knorpel erzielt (407 bzw. 995 pg FGF-2/ml). In den Negativkontrollen lagen die FGF-2-Spiegel jeweils unterhalb der Nachweisgrenze des Tests. Histomorphometrisch zeigte sich kein Unterschied in der Safranin-O- bzw. der Typ-II-Kollagen-Färbeintensität in rAAV-FGF-2-transduzierten Knorpelexplantaten. Der Proteoglykangehalt der humanen normalen und arthrotischen Gelenkknorpelexplantate war nach Applikation von rAAV-FGF-2 nicht signifikant verändert. Im Gegensatz dazu führte die direkte Applikation von rAAV-FGF-2 zu einem signifikanten Anstieg der Zelldichten in humanen normalen und arthrotischen Gelenkknorpelexplantaten. rAAV-FGF-2 führte ebenfalls zu einer Zunahme des DNS-Gehaltes der Knorpelexplantate (1,47 ± 0,03 ug/mg Trockenmasse mit 20 ul rAAV-hFGF-2 und 1,73 ± 0.03 ug/mg Trockenmasse mit 50 ul in humanem normalen Knorpel, verglichen mit 1,28 ± 0,01 und 1,32 ± 0,01 ug/mg Trockenmasse in Kontrollkulturen; P < 0.001). In arthrotischen Gelenkknorpelexplantaten war ein identischer Effekt zu verzeichnen (1,38 ± 0,03 und 1,51 ± 0,04 ug/mg Trockenmasse mit 20 und 50 ul rAAV-hFGF-2, verglichen mit 1,24 ± 0,01 und 1,25 ± 0,02 ug/mg Trockenmasse in Kontrollkulturen P < 0.001).
Schlussfolgerungen: Direkte rAAV-vermittelte Überexpression von FGF-2 stimuliert die Chondrozytenproliferation in humanem normalen und arthrotischen Gelenkknorpel in situ. Diese Daten unterstützen das Konzept der Anwendung von therapeutischen rAAV-Gentransfervektoren zur Behandlung von traumatischen und arthrotischen Gelenkknorpeldefekten.
