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Fragestellung: Die Integrität der zellulären Wechselwirkung ist eine Vorraussetzung für die Geweberegeneration, die nach Trauma oder im Rahmen einer Gewebetransplantation gefordert ist. Das Überleben des Gewebes ist nur dann gesichert, wenn Endothelzellen und Bindegewebszellen (Fibroblasten) in der Frühphase der Regeneration ein funktionierendes Netzwerk ausbilden. Zur Untersuchung der grundlegenden Prozesse dieser Angiointegration sind bisher zur Verfügung stehende Mono-Zellkultur-Modelle wenig geeignet, da die Zellen in Monokulturen rasch in Richtungen differenzieren, die mit dem in vivo-Zustand nur noch wenig gemeinsam haben. Wir stellen ein Co-Kultur-Modell aus humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) und normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHDF) vor, das mit einem in vitro-Wundheilungs-Assay kombiniert wurde.

Methodik: Zur Optimierung der Co-Kultur wurden die primären Zelltypen HDMEC und NHDF (PromoCell, Heidelberg, Germany) separat kultiviert, dann in einem Spezialmedium zusammen für eine unterschiedliche Dauer kultiviert (n = 21). Mittels immunzytochemischer Färbungen mit Antikörpern gegen Factor-VIII-related antigen, EDA-Fibronektin und α-Smooth-muscle-actin konnten exakte Zahlenverhältnisse der Zellen zueinander und die Differenzierung der NHDF zu Myofibroblasten (MF) bestimmt werden. Nach Standardisierung des Modells wurden Co-Kulturen in einem Wundheilungs-Assay genutzt (n = 5), um zusätzlich zu oben genannten Parametern eine Aussage über ihre Migrationsfähigkeit in Abhängigkeit des Einflusses von Hypoxie (<5mmHg O2) und der zusätzlichen Gabe von Transforming growth factor ß1 (TGFß1) (c = 1ng/ml) zu erhalten.

Ergebnisse: In der Co-Kultur kommt es zu einer verstärkten Differenzierung der NHDF zu MF im Bereich der HDMEC-Cluster. 80% der MF befinden sich in der Nähe der Cluster, nur 20% in weiterer Entfernung. Die MF-Anzahl korreliert positiv mit der Anzahl der HDMEC. Co-Kulturen von HDMEC und NDHF bleiben für die Dauer von mindestens drei Tagen derart stabil, dass die Kombination mit einem Wundheilungs-Assay möglich ist. Dieser Assay zeigt, dass Hypoxie wie erwartet einen negativen Einfluss auf die Migration der Zellen in die gesetzte Wunde hat. TGFß1-Zugabe führt zur vermehrten Bildung von MF, die durch Hypoxie noch weiter getriggert wird. Die direkte Interaktion von HDMEC und MF am Wundrand führt zur Ausbildung von Spheroiden. Diejenigen Fibroblasten, die in die Wunde migrieren, zeigen ein charakteristisches Verteilungsmuster von EDA-Fibronektin.

Schlussfolgerung: Die Co-Kultivierung von HDMEC und NHDF in Kombination mit einem Wundheilungs-Assay eignet sich zur Überprüfung unterschiedlichster Einflussgrößen, die für die Angiointegration von zentraler Bedeutung sind und zeigt Verhaltensmuster der Zellen, wie z.B. die Ausbildung von Spheroiden, die in Monokulturen unter den gleichen Einflussgrößen nicht beobachtet werden.