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Fragestellung: Die Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten (MF) spielt sowohl bei der Genese fibrotischer Erkrankungen als auch bei der Wundheilung eine wichtige Rolle. Im Rahmen eines europäischen Forschungsverbundes untersuchen wir Möglichkeiten, Transforming Growth Factor beta 1 (TGF b1) als Induktor der Myofibroblasten-Differenzierung an funktionalisierte Oberflächen zu binden. Die differenzierende Wirkung der TGF b1-beschichteten Oberflächen wurde in Zellkulturversuchen mit normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHDF) untersucht.

Methodik: Als Substrate für die Immobilisierung von TGF b1 dienten Aldehyd-funktionalisierte Objektträger zweier Hersteller, sowie aminosilanisierte Objektträger, die innerhalb des Verbundes hergestellt wurden. Zur Kopplung von TGF b1 über seine Aminogruppen an die Aldehyd-funktionalisierten Objektträger wurde TGF b1 in einer Konzentration von 5 µg/ml auf die Objektträger aufgetragen, 2 h inkubiert und die enstehenden Schiff´sche Basen nachfolgend reduziert. Nicht umgesetzte Aldehydgruppen wurden mit Zellkulturmedium geblockt. Um TGF b1 an die aminosilanisierten Objektträger zu koppeln, mussten dessen Carboxylgruppen zunächst mit Carbodiimid aktiviert werden. Der Erfolg der Immobilisierung wurde jeweils mittels LSAB-Nachweis überprüft. NHDF wurden mit einer Dichte von 63 Zellen/mm2 ausgesät und 2 Tage inkubiert. Nach Immunfloureszenzfärbung des MF-Markerproteins a-smooth-muscle actin (a-SMA) konnte mikroskopisch der Anteil a-SMA-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl bestimmt werden. Zur statistischen Absicherung wurde ein t-Test für Paardifferenzen durchgeführt.

Ergebnisse: Sowohl bei den aldehyd-funktionalisierten als auch bei den aminosilanisierten Objektträgern war der semi-quantitative Nachweis der Immobilisierung im LSAB-Nachweis möglich. Bei Verwendung der Aldehyd-funktionalisierten Objektträger (Hersteller 1) konnte ein Anstieg der Differenzierungsrate gegenüber der unbeschichteten Kontrolle von 6,4% beobachtet werden (n = 6, p = 0,01). Die Übertragung der Kopplungschemie auf die Objektträger von Hersteller 2 ergab im Zellkulturversuch eine Steigerung von 9,4% (n = 5, p = 0,01). In Vorexperimenten mit aminosilanisierten Objektträgern konnte eine Steigerung der MF-Differenzierungsrate um 5,6% bestimmt werden (n = 2).

Schlussfolgerung: Der LSAB-Nachweis stellt eine einfache und günstige Methode zum semi-quantitativen Nachweis der Immobilisierung dar. Die Kopplung von TGF b1 an aldehyd- und aminofunktionaliserte Oberflächen ist unter Beibehaltung der biologischen Aktivität möglich. Auf den TGF b1-beschichteten Bereichen konnte in allen Fällen eine signifikante Steigerung der MF-Differenzierungsrate beobachet werden. Mit Hinblick auf die Entwicklung funktionaler Hauttransplantate bestehend aus Fibroblasten, Keratinozyten und Endothelzellen sollen in Zukunft weitere Zytokine wie z.B. VEGF, bFGF oder PDGF sowie Matrixproteine immobilisert werden.