gms | German Medical Science

Aus dem Knochenmark stammende, zirkulierende Endothelvorläuferzellen (EPC) sind an der Neovaskulogenese nach ischämischen Ereignissen beteiligt und können eine therapeutische Option für die Re- bzw. Neovaskularisierung verletzter Regionen nach einem Trauma darstellen. Dafür ist es aber notwendig mehr über die Wirkung solcher Mediatoren auf EPCs zu erfahren, die nach einem Polytrauma lokal und/oder systemisch erhöht vorliegen können. Mittels RT-PCR konnte bei EPCs eine deutliche Genexpression von Rezeptoren für IL-1β, TNF-α und VEGF nachgewiesen werden. Daher wurde in der hier vorliegenden Studie die Wirkung von TNF-α, IL-1β und VEGF in Konzentrationen, wie sie nach einem Polytrauma auftreten können, auf die Anzahl (Fluoreszenzmikroskopie) und Apoptose (Durchflusszytometrie) von differenzierten EPCs in vitro untersucht.

EPCs aus Buffy-Coat wurden über Dichtegradientenzentrifugation isoliert und in Fibronectin beschichtete Kulturgefäße mit Endothelzell-Basalmedium supplementiert mit 20% Humanserum (HS) für 3 Tage differenziert. Danach wurden die Zellen im Überstand entfernt. Die EPCs sind in den adhärenten Zellen enthalten. Die Ansätze wurden für weitere 48 h mit frischem Medium inkubiert, um die Zelldifferenzierung abzuschliessen. In parallelen Ansätzen wurden rekombinant humanes (rh) TNF-α oder rhIL-1β [beide 50 units/ml] oder rhVEGF [1.0 ng/ml] zugegeben und für 3h bzw. 24h bei 37°C inkubiert (n=5). EPCs wurden über die simultane Aufnahme von DiL-Acetyl-LDL (DiL) und der Bindung von UEA-I-Lectin-FITC nachgewiesen. Zur Bestimmung der EPC-Zahl wurden am Fluoreszenzmikroskop je 5 randomisierte Gesichtsfelder ausgezählt. Apoptotische EPCs wurden über eine Doppelfärbung mit DiL und der Bindung von Annexin-V-FITC durchflusszytometrisch bestimmt. Ergebnisse werden als Mittelwerte +/- SEM präsentiert. Signifikanzüberprüfung erfolgte mit dem Wilcoxon-Test, p<0.05 ist signifikant.

Inkubation mit TNF-α führte nach 3h zu einer signifikanten Zunahme apoptotischer EPCs von 9.8% +/- 1.6 auf 18.4% +/- 2.9, Inkubation mit IL-1β erhöhte den Anteil apoptotischer Zellen auf 25.5% +/- 3.4. Nach 24 h Inkubation mit TNF-α, bzw. IL-1β konnte ein signifikanter Rückgang der EPC-Zahl/Gesichtsfeld beobachtet werden (Kontrolle: 40.0 +/- 4.5; TNF-α: 12.7 +/- 1.5; IL-1β: 23.3 +/- 4.0). VEGF führte weder zu einer veränderten Apoptoserate noch zu einer signifikanten Änderung der EPC-Zahl gegenüber den Kontrollansätzen.

In einer zurückliegenden Studie konnten wir demonstrieren, dass die EPC-Differenzierung durch TNF-α und IL-1β massiv beeinträchtigt wird. In der aktuellen Studie zeigen wir nun, dass beide Zytokine in physiologischen Konzentrationen auch die Anzahl ausdifferenzierter EPCs in vitro signifikant reduzieren und zwar über die Auslösung der Apoptose. Ob eine Blockade dieser Mediatoren die Revaskularisierung verletzter Regionen verbessert, muss jedoch mit geeigneten Tiermodellen überprüft werden.