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Schnellere Redifferenzierung von kultivierten Chondrozyten durch Beeinflussung des Stickstoffmonoxyd-Stoffwechsels
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Autoren
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Harald Gloger
- Chirurgische Klinik und Poliklinik der Universität Würzburg, Abt. für Unfallchirurgie, Josef-Schneider-Str. 2, 97080, Würzburg, Phone: 0931/201-1
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T. Heintel
- Chirurgische Klinik und Poliklinik der Universität Würzburg, Abt. für Unfallchirurgie, Josef-Schneider-Str. 2, 97080, Würzburg, Phone: 0931/201-1
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A. Weckbach
- Chirurgische Klinik und Poliklinik der Universität Würzburg, Abt. für Unfallchirurgie, Josef-Schneider-Str. 2, 97080, Würzburg, Phone: 0931/201-1
| Veröffentlicht: | 11. November 2003 |
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Gliederung
Text
Fragestellung
Zur Herstellung von Knorpelgewebe aus Chondrozytenkulturen ist die Produktion der extrazellulären Matrix (ECM) von entscheidender Bedeutung. Die Matrixproduktionsfähigkeit der Zellkulturen ist abhängig vom Differenzierungsgrad der Zellen. In vitro amplifizierte Chondrozyten dedifferenzieren mit der Zeit. Einer Redifferenzierung der Zellen kommt somit eine zentrale Bedeutung zu. Die vorliegende Studie beschäftigte sich mit der Beobachtung der Redifferenzierungszeit der Chondrozyten durch Beeinflussung des Stickstoffmonoxyd-Stoffwechsels.
Methoden
Chondrozyten von menschlichen Femurköpfen wurden nach einem standardisierten Protokoll isoliert. Die Zellen wurden in Monolayerkultur über vier Wochen vermehrt. Je 250.000 dieser so amplifizierten Zellen wurden zu "high-density-pellets" zentrifugiert. Diese Pellets wurden drei Wochen lang in chondrogenem Differenzierungsmedium kultiviert. Eine Gruppe dieser Zellpellets wurde unter Standardbedingungen kultiviert (Kontrolle). In einer zweiten Gruppe erfolgte eine Stimulation der Stickstoffmonoxyd-Synthase (NOS) durch Zusatz von 500 µg/ml Interleukin-1 beta (IL-1β) und in einer dritten Gruppe wurde die NOS durch 200 µmol N-Amino-L-Arginine (L-NAA) inhibiert. RT-PCR-Kontrollen der Expression der Matrixgene wurden nach 1, 7, 14 und 21 Tagen durchgeführt (Aggrecan, Kollagen Typ II, GAPDH, iNOS, eNOS, nNOS). Histochemische und immunhistochemische Untersuchungen (Alzian Blau, Kollagen Typ II) wurden nach 7, 14 und 21 Tagen durchgeführt.
Ergebnisse
Es zeigte sich eine Redifferenzierung der expandierten Chondrozyten im Zellpellet mit Ausbildung einer knorpeltypischen extrazellulären Matrix. Mittels RT-PCR-Analysen ließ sich in allen Gruppen ab dem ersten Tag eine Expression der neuronalen, induzierbaren und endothelialen NOS nachweisen. Die mit IL-1β inkubierten Pellets wiesen im Vergleich zur Kontrolle eine deutlich höhere Expression der induzierbaren NOS (iNOS) sowie eine geringere Expression der knorpelspezifischen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan auf. Bei den unter dem Einfluß von L-NAA redifferenzierten Zellen konnte eine im Vergleich zur Kontrolle deutlich frühere Expression dieser Markergene nach etwa 7 Tagen detektiert werden (Kontrolle: 14-21 Tage). Sowohl in der immunhistochemischen Färbung von Kollagen Typ II, als auch in der Alzian-Blau-Färbung ließ sich dies im morphologischen Korrelat bestätigen.
Schlussfolgerungen
Im verwendeten Modell läßt sich die Redifferenzierung von in vitro vermehrten Chondrozyten unter standardisierten Bedingungen untersuchen. Durch die Stimulation der endogenen NO-Synthese mit IL-1β kam es zu einer Abnahme der Genexpression der wichtigsten Matrixproteine des hyalinen Gelenkknorpels. Durch die Inhibition der NO-Synthese mit L-NAA kam es im Vergleich zur Kontrolle zu einer deutlich früheren Expresssion der knorpelspezifischen Markergene und zu einer früheren Ausbildung einer knorpeltypischen ECM.
