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Einleitung: Der Morbus Hirschsprung (HSCR, MIM # 142623) manifestiert sich in der Ausbildung einer funktionellen Darmstenose als Folge einer Aganglionose mit reaktiver Dilatation des gesunden Darmes. „Loss of function“-Keimbahnmutationen treten im RET-Protoonkogen (MIM # 164761) bei Patienten mit der sporadischen sowie der familiären Form des HSCR auf. Unabhängig davon sind Varianten mehrerer RET-Polymorphismen mit dem HSCR-Phänotyp assoziiert. Der -5G>A Polymorphismus im RET-Promotor steht im strengen Kopplungsungleichgewicht mit dem c.135G>A Polymorphismus, ist funktionell wirksam und hat eine ätiologische Bedeutung bei der Genese von HSCR. Weiterhin wurde ein Enhancerelement im Intron 1 beschrieben, dessen Polymorphismus mit dem HSCR assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die funktionelle Bedeutung von Promotor- und 3’UTR-Varianten sowie des Enhancers im Intron 1.

Material und Methoden: Die funktionellen Untersuchungen der Promotorvariante +64G>T, die bei einem unserer HSCR-Patienten und nicht in der Normalbevölkerung vorkommt, und des häufigen 124A>G Polymorphismus im 3'UTR, der im Kopplungsungleichgewicht mit der -5G>A Varianten steht, erfolgte jeweils durch PCR-Klonierung in einen pGL3 Vektor. Nach transienter Transfektion von humanen RET-exprimierenden Neuroblastomzellinien wurde die Aktivität des Promotorelementes bzw. Instabilität der mRNA anhand des Dual-Luciferase® Reporter (DLR) Assay Systems bestimmt. Zur Bestimmung der Allelfrequenz der Varianten im Promotor, im Intron 1 und im Exon 2 wurden 86 HSCR-Patienten und 130 anonyme gesunde Blutspender als Kontrollgruppe durch direkte DNA Sequenzierung genotypisiert. Weiterhin haben wir eine 916bp genomische Region des Introns1 im RET, die drei streng im Kopplungsungleichgewicht stehende Polymorphismen und die Enhancersequenz umfasst, kloniert und deren Aktivität anhand des Dual-Luciferase® Reporter (DLR) Assay Systems analysiert.

Ergebnisse: Bei der Analyse der Promotorvariante +64 G>T sowie des 3'UTR-Polymorphismus konnten wir keinen signifikanten Aktivitätsunterschied zwischen den beiden Allelen feststellen.Wir konnte jedoch ein strenges Kopplungsungleichgewicht zwischen dem funktionellen RET-Promotorpolymorphismus, dem Intron 1 Polymorphismus und dem c.135G>A Polymorphismus in Exon 2 zeigen. Wir fanden jedoch einen 30-fachen Aktivitätsunterschied zwischen dem Wildtyp und den Enhancer-Varianten nach Transfektion in menschliche Neuroblastomzellinien. Untersuchungen der Interaktion des Enhancers im Intron 1 mit dem minimalen RET-Promoter und seinem funktionellen Polymorphismus sind im Gange.

Schlussfolgerung: Offensichtlich tragen sowohl „Loss of function“-Keimbahnmutationen als auch regulatorische Varianten im Promotor und im Enhancer des RET-Protoonkogens zur Entwicklung eines Morbus Hirschsprung bei. Inwieweit Promotor- und Enhancervarianten zusammen wirken, muss gezeigt werden.