gms | German Medical Science

Fragestellung: Bei Skeletterkrankungen wie Osteoporose spielen Osteoklasten eine große Rolle. Zugrunde liegende Prozesse könnten durch gezielte Adressierung von Osteoklasten aufgeklärt und Therapieansätze entwickelt werden. Clostridium botulinum C3-Toxin, das nach bisherigem Kenntnisstand selektiv von Monozyten aufgenommen wird und in enzymatisch aktiver Form die ADP-Ribosylierung von Rho bewirkt, könnte hierfür geeignet sein. Als molekulares Trojanisches Pferd könnten enzymatisch inaktives C3-Protein oder ein rekombinantes Fusionstoxin therapeutisch relevante (Makro)moleküle in das Zytosol monozytärer Zellen transportieren.

Ziel dieser Studie war es, die vermutete Aufnahme des enzymatisch aktiven C3-Proteins von undifferenzierten RAW 264.7-Zellen und osteoklastär differenzierten Zellen zu untersuchen und festzustellen, inwiefern die ADP-Ribosylierung von Rho durch C3-Toxin die Zellmorphologie und -differenzierung beeinflusst. Außerdem wurde die Resorptionsfähigkeit der differenzierten RAW 264.7-Zellen in Anwesenheit von C3-Toxin analysiert.

Methodik: Undifferenzierte RAW 264.7-Zellen (α-Medium, 10 % fötales Kälberserum, 37 °C, 5 % CO₂) wurden 2 Tage kultiviert, bevor C3-Toxin 6 h zugegeben wurde. Das Toxin wurde mittels (Immun)fluoreszenzfärbung von Aktin und C3-Toxin intrazellulär nachgewiesen. Der ADP-Ribosylierungsstatus von Rho in C3-Toxin-behandelten Zellen wurde durch sequentielle in vitro-ADP-Ribosylierung bestimmt.

Um RAW 264.7-Zellen osteoklastär zu differenzieren, wurden dem Medium 40 ng/ml receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) zugesetzt. Die C3 Toxin-Zugabe erfolgte nach 4, 24 und 48 h. Nach einer Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP)-Färbung an Tag 5 wurden die TRAP-positiven, multinukleären Zellen (≥ 3 Kerne) quantifiziert. Die Aktivität der Zellen wurde auf synthetischen CaP-Oberflächen anhand der resorbierten Fläche (Software MetaMorph, Leica Microsystems) bestimmt. (Students t-Test, p < 0,05)

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Das C3-Toxin wurde intrazellulär nachgewiesen. In Anwesenheit von C3-Toxin bildeten sich charakteristische, große und flache Zellen mit langen, dünnen und teilweise verzweigten Ausläufern. Die Menge an ADP-ribosyliertem Rho in mit C3-Toxin behandelten Zellen war wie erwartet deutlich größer als bei unbehandelten Zellen.

Die Bildung TRAP-positiver, multinukleärer Zellen wurde am stärksten bei Zugabe des C3-Toxins zum frühesten Zeitpunkt (4 h) behindert. Die Resorptionsfähigkeit der osteoklastären Zellen wurde durch das C3-Toxin gesenkt, auch bei Zugabe ab Tag 5 nachdem sich bereits mehrkernige Zellen gebildet hatten.

Der erfolgreiche Transport des C3-Proteins in undifferenzierte und osteoklastär differenzierte Zellen der Monozyten-Linie und die Möglichkeit der gezielten Beeinflussung Rho-abhängiger Prozesse lassen C3-Toxin für weiterführende Analysen sowie für das Einschleusen therapeutisch relevanter Moleküle in diese Zellen geeignet erscheinen.