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Die Effekte verschiedener basaler Zellkultur-Induktionsmedien und deren Auswirkungen auf das osteogene Potential humaner mesenchymaler Stammzellen quantifiziert mit 99mTc-MDP-Labeling
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Tobias Großner
- Universitätsklinikum Heidelberg, Department Orthopädie und Unfallchirurgie, Sektion Experimentelle Orthopädie, Heidelberg, Germany
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Tobias Gotterbarm
- Universitätsklinikum Heidelberg, Department Orthopädie und Unfallchirurgie, Sektion Experimentelle Orthopädie, Heidelberg, Germany
| Published: | October 23, 2013 |
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Fragestellung: Eine maximale Steigerung der Osteogenese ist eines der obersten Ziele in der Monolayerkultur humaner mesenchymaler Stammzelllen, die osteogen induziert werden. Es gibt eine Vielzahl von Nährmedien und Supplements auf dem industriellen Markt, welche hierfür verwendet werden. Das osteogene Potential der einzelnen Nährmedien und Supplements, gemessen an der neu synthetisierten Menge an Hydroxylapatit, ist weitestgehend unbekannt.
99mTc-MDP eignet sich dazu, die erfolgreiche Osteogenese in der Monolayerkultur nachzuweisen und zu quantifizieren, da es sich hoch-affin an neu gebildetes Hydroxylapatit anlagert und der Uptake mit einer Gamma-Kamera gemessen werden kann.
Wir haben das osteogene Potential von fünf basalen Zellkulturmedien in Kombination mit unterschiedlichen Supplements während der osteogenen Induktion bestimmt, zuvor erfolgte die Expansion der Zellen mit DMEM-F12 + TGF-ß1 und FGF.
Methodik: 250.000 humane mesenchymale Stammzellen (n=6) wurden in T-150-Flaschen ausgelegt und mit DMEM-F12 + 10%FCS + 1%P/S + TGF-ß1 (1ng/ml) + FGF (5ng/ml) für 10 Tage expandiert. Dann erfolgte der Transfer der Zellen in 35mm Petri Schalen mit 30.000 Zellen/cm2 (10 Schalen/Spender). Je eine Schale von jedem Spender wurde mit 2ml eines der fünf basalen Zellkulturmedien ausgelegt: 1) DMEM low glucose + 10% FCS + 1% P/S; 2) DMEM high glucose + 10% FCS + 1% P/S; 3) Alpha-MEM + 10% FCS + 1%P/S; 4) DMEM-F12 + 10% FCS + 1%P/S + TGF-ß1 (1ng/ml) + FGF (5ng/ml); 5) DMEM high glucose + MCDB 201 + 2% FKS + IST Supp. + 1% P/S + 0,02µM Dexamethason + 0,1µM Ascorbinsäure2-phosphat + EGF 10 ng/ml + PDGF 10ng/ml (Verfaillie-Media). Zu jedem Medium wurden die osteogenen Zusätze 10mM ß-Glycerol Phosphat +173µM Ascorbinsäure2-phosphat und 100 nM Dexamethason hinzugefügt. Die anderen 5 Schalen wurden ebenfalls mit den oben genannten Medien gefüllt, jedoch ohne die osteogenen Zusätze (Kontrollgruppe). Die Zellkultur erfolgte bei 37°C und 5% CO2 mit 2-tägigem Mediumwechsel.
Nach 21 Tagen wurden die Petrischalen mit je 5,5 MBq 99mTc-MDP inkubiert (2h Inkubation), gewaschen und die Restaktivität per Zählrate der Gammacounts (über 180 Sekunden) mit einer Gamma-Kamera bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es zeigte sich, dass nach Zellexpansion mit DMEM-F12 und TGF-ß1 + FGF nur die Zellen, die in DMEM LG sowie in Verfaillie-Medium induziert wurden, einen statistisch signifikant höheren Uptake bei der Anzahl der Gammacounts gegen die Kontrolle zeigten (t-Test; p=0,007 und p=0,006). Das geringste osteogene Potential wurde bei den Zellen gemessen, welche mit DMEM-F12 + TGF-ß1 + FGF induziert wurden, vermutlich agiert hier TGF-ß1 als potenter Inhibitor der Osteogenese.
Die einfaktorielle ANOVA-Analyse zeigte, dass innerhalb der osteogenen Gruppe nur das Verfaillie-Medium einen signifikant höheren Uptake gegenüber dem DMEM-F12 Medium hatte.
Zellexpansion mit DMEM-F12 + TGF-ß1 + FGF gefolgt von osteogener Induktion mit Verfaillie-Medium zeigte in den untersuchten Medium-Kombinationen das höchste osteogene Potential.
