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99mTc-HDP-Labeling – eine hochsensitive Methode für den Nachweis und die Quantifizierung der osteogenen Differenzierung und des osteogenen Potentials humaner mesenchymaler Stammzellen in der Frühphase der Monolayerkultur
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Authors
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Tobias Großner
- Universitätsklinikum Heidelberg, Department Orthopädie und Unfallchirurgie, Sektion Experimentelle Orthopädie, Heidelberg, Germany
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Uwe Haberkorn
- Universitätsklinikum Heidelberg, Radiologische Klinik und Poliklinik, Abteilung Nuklearmedizin, Heidelberg, Germany
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Tobias Gotterbarm
- Universitätsklinikum Heidelberg, Department Orthopädie und Unfallchirurgie, Sektion Experimentelle Orthopädie, Heidelberg, Germany
| Published: | October 23, 2013 |
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Fragestellung: Osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSCs) ist eine Standardmethode im Tissue Engineering. Der erfolgreiche Nachweis der Osteogenese wird üblicher Weise qualitativ und (semi-)quantitativ durch Alizarin-Rot Färbung erbracht.
99mTc-HDP eignet sich dazu, die erfolgreiche Osteogenese in der Monolayerkultur nachzuweisen und zu quantifizieren, da es sich hoch-affin an neu gebildetes Hydroxylapatit anlagert und der Uptake per Aktivitimeter und Gamma-Kamera gemessen werden kann. Unklar war, ob das 99mTc-HDP-Labeling eine sensitivere Methode darstellt als der Gold-Standard der Alizarin-Rot Färbung.
Methodik: Pro Spender wurden zehn 35mm Petrischalen (30.000 Zellen/cm2) mit humanen mesenchymalen Stammzellen (n=6) ausgelegt, je 5 Schalen erhielten 1ml osteogenes Medium (DMEM low glucose + 10%FCS + 1%P/S und den osteogenen Supplements 10mM Beta-Glycerol Phosphat +173µM Ascorbin Säure 2-phosphate + 100 nM Dexamethason) und weitere 5 dienten als Kontrolle (DMEM low glucose + 10%FCS + 1%P/S). Zellkultur erfolgte bei 37°C und 5% CO2 mit 2-tägigem Mediumwechsel.
Nach 1, 4, 7, 14, und 21 Tagen wurde von jedem Spender und Gruppe eine Petrischale mit 5,5 MBq 99mTc-HDP in NaCl 0,9% inkubiert (2 h Inkubation, 20°C), 3x gewaschen und die Restaktivität mit einem Aktivitimeter gemessen (MBq). Die Zählrate (Gammacounts) wurde zusätzlich über 180 Sekunden mit einer Gamma-Kamera bestimmt. Anschließend wurden die Kulturen mit 0,5% Alizarin-Rot Lösung gefärbt, der gebundene Farbstoff mit CPC Lösung extrahiert und photometrisch die Absorption bei 570nm bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: An Tag 1 und 4 konnte durch keine der 3 Methoden ein signifikanter Unterschied in den beiden Gruppen gezeigt werden. Bereits an Tag 7 zeigte die osteogene Gruppe verglichen mit der Kontrolle eine signifikant höhere Aktivität in MBq (p=0,017, students T-test) sowie einen hochsignifikanten Unterschied bei den Gammacounts (p=0,001, students T-test) sowie darauffolgend auch an Tag 14 und 21.
Mit der Standardmethode der Alizarin-Rot Färbung konnte erst nach 21 Tagen ein Unterschied zwischen den Gruppen gezeigt werden (p=0,015, students T-test).
Die Korrelationsanalyse zeigte an Tag 21 für beide Methoden eine hohe Korrelation von 0,789 bzw. 0,790 (p=0,02) mit der gemessenen Alizarin-Rot Absoption.
99mTc-HDP-Labeling ist dem Standardverfahren der Alizarin-Rot Färbung zum qualitativen und quantitativen Nachweis der erfolgreichen Osteogenese in der Sensitivität deutlich überlegen. Durch die Anreicherung lässt sich bereits in der Frühphase nach 7 Tagen, nicht-destruktiv, die osteogene Differenzierung nicht nur nachweisen, sondern auch quantifizieren.
