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Intrazelluläre Markierung mesenchymaler Stammzellen mit Ferucarbotran und Co-Transduktion mit eGFP: Erhalt der chondrogenen Differenzierungskapazität bei signifikantem Kontrastmitteleffekt im MRT
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Published: | October 23, 2013 |
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Fragestellung: In den letzten Jahren wurden insbesondere in tierexperimentellen Studien neben Chondrozyten vermehrt mesenchymale Stammzellen (MSZ) zur Therapie von Knorpeldefekten verwendet. Ziel der aktuellen Studie war es, ein experimentelles Zellmodell mit MSZ vom Kaninchen zu entwickeln, welches ein Zell-Monitoring im MRT und eine gleichzeitige histologische Kontrolle durch eGFP (enhanced green fluorescent protein) ermöglichte. Nach intrazellulärer Markierung mit dem Eisen-Kontrastmittel Ferucarbotran sollte weder die Proliferation oder Viabilität noch die chondrogene Differenzierungskapazität der Zellen beeinträchtigt sein; gleichzeitig sollte der Kontrastmitteleffekt sowie die eGFP-Expression zur histologischen Korrelation maximiert werden.
Methodik: MSZ wurden von New Zealand White-Kaninchen isoliert, lentiviral mit unterschiedlichen Virustitern von eGFP transduziert und mit Ferucarbotran mit unterschiedlichen Konzentrationen (12,5; 25; 50 und 100 µg/ml) markiert. Der Prozentsatz an eGFP-positiven Zellen (eGFP+) und die mittlere Fluoreszenzintenistät (MFI) wurde mithilfe von Durchflusszytometrie bestimmt. Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie (IDMS), Berliner-Blau-Färbungen sowie MRT-Aufnahmen belegten die intrazelluläre Eisenaufnahme. Zellviabilität sowie Apoptoseverhalten wurde mittels XTT-Test bzw. Caspase-3/-7-Messungen analysiert. Die chondrogene Differenzierungskapazität der markierten MSZ wurde im Pelletassay nach 18 Tagen in Kultur mit Induktionsmedium durch Glycosaminoglykan-Quantifizierungen beurteilt. Markierte Zellen und unmarkierte Kontrollen wurden unter Verwendung von T1-, T2- und T2*-gewichteten Pulssequenzen vor und nach Differenzierung mittels MRT untersucht. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt; die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Über 90% der transduzierten MSZ exprimierten eGFP. Höhere Virustiter zeigten einen höheren Prozentsatz an eGFP+-Zellen sowie eine erhöhte MFI. Die intrazelluläre Eisenaufnahme war für alle applizierten Konzentrationen signifikant (p< 0,05) und dosisabhängig (3,3±0,2; 5,0±0,5; 10,0±1,0 und 56,5±5,5 pg Fe/Zelle). Die Berliner Blau-Färbungen zeigten perinukleäre Zelleinschlüsse. Im Vergleich zu untransduzierten oder unmarkierten Kontrollen ergab sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich Zellviabilität, Apoptoserate oder chondrogener Differenzierungskapazität (p>0,05). Ferucarbotran-markierte MSZ zeigten bei allen MR-Pulssequenzen einen starken Kontrast und einen signifikanten Abfall in T2- und T2* Relaxationszeiten.
Die intrazelluläre Markierung von MSZ vom Kaninchen mit Ferucarbotran sowie die Transduktion mit eGFP beeinflusste weder die Zellviabilität, das Apoptoseverhalten noch die chondrogene Differenzierungskapazität. Ein signifikanter Kontrastmitteleffekt der markierten Zellen im MRT sowie eine hohe lentivirale Transduktionseffizienz sind Voraussetzungen für ein späteres Zell-Monitoring in vivo mittels MRT und nachfolgende histologische Analysen eGFP-transduzierter MSZ ex vivo.