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Die Rolle von Mcl-1 in der Apoptoseregulation in neutrophilen Granulozyten nach schwerem Trauma
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Published: | October 23, 2013 |
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Fragestellung: Die massive Einwanderung aktivierter neutrophiler Granulozyten (PMN) zum Ort eines Traumas sowie daraus resultierende sekundäre Gewebeschädigungen und frühes multiples Organversagen sind mit der gestörten PMN-Apoptose assoziiert. Wie wir bereits zeigen konnten, spielt der antiapoptotische Faktor Mcl-1 eine Schlüsselrolle in der Regulation der PMN-Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir bis dato unberücksichtigte Aspekte der Modulation der Mcl-1 Expression untersucht, was neue Erkenntnisse für die Aufklärung der Apoptoseresistenz in PMN nach schwerem Trauma liefern kann.
Methodik: PMN aus dem Blut polytraumatisierter Patienten (n=20, ISS>16, ICU>3) wurden am Tag 1 nach dem Trauma isoliert. Als Kontrolle diente ein vergleichbares Kollektiv gesunder Probanden. Mitochondriale Membrandepolarisation wurde anhand der Emission des Farbstoffs JC-1 mittels FACS-Analyse bestimmt. Die Apoptoserate wurde mittels Propidiumiodidfärbung der DNA und anschließender FACS-Analyse quantifiziert. Die Expression von Mcl-1 wurde auf mRNA sowie auf Proteinebene mittels qRT-PCR und Western-Blot-Technik untersucht. Die Interaktion von Proteinen der Bcl-2 Familie wurde mittels Co-Immunpräzipitation analysiert. Für die Untersuchung der Translokation proapoptotischer Faktoren zu den Mitochondrien wurden Zellfraktionierung und anschließende Western-Blot-Analysen durchgeführt, unterstützt durch Immunfluoreszenz-Experimente. Die Untersuchung der Caspase-Aktivitäten erfolgte unter Anwendung von Lumineszenz-Assays.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Hier zeigen wir, dass im extrinsischen und intrinsischen Apoptosesignalweg das Protein Mcl-1 Caspase- und Proteasom-abhängig abgebaut wird. Außerdem zeigen wir, dass Mcl-1 direkt mit den proapoptotischen Proteinen Bax und Bid interagiert. Interessanterweise war diese Interaktion zwischen Mcl-1 und Bax/Bid in PMN polytraumatisierter Patienten erhöht. Wir fanden außerdem, dass der Abbau von Mcl-1 in Kontroll PMN nach Aktivierung des extrinsischen sowie intrinsischen Apoptosesignalweges mit mitochondrialer Translokation von aktivierten Bax und Bid, dem Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, dem Austritt von Cytochrom C aus den Mitochondrien sowie der Erhöhung der Apoptoserate assoziiert war. In PMN polytraumatisierter Patienten konnte eine solche Korrelation ausschließlich nur nach Aktivierung des extrinsischen Apoptosesignalweges beobachtet werden, wohingegen der intrinsische Apoptosesignalweg gestört war. Diese intrinsische Apoptoseresistenz und Mcl-1 Stabilisierung war mit der Hemmung der Bax und Bid Translokation sowie des Cytochrom C Austritts aus den Mitochondrien verbunden.
Das Protein Mcl-1 übt eine entscheidende Rolle auf die Regulation der PMN-Apoptose aus, wobei in PMN polytraumatisierter Patienten ein erhöhter Mcl-1 Proteinlevel mit intrinsischer Apoptoseresistenz und verlängerter Lebensdauer korreliert. Mcl-1 stellt daher ein potentielles therapeutisches Target für die Apoptoseinduktion in PMN nach einem schweren Trauma dar.