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Überexpression von humanem IGF-I via rAAV stimuliert die Proliferation und Synthese von Proteoglykanen und Typ-II-Kollagen in humanen normalen und arthrotischen Chondrozyten in vitro
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Published: | October 21, 2010 |
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Fragestellung: Gentransfer therapeutischer Faktoren verbessert die Reparatur von Gelenkknorpeldefekten im Tiermodell. Ex-vivo-Gentransfer von insulinartigem Wachstumsfaktor I (IGF-I) mittels transfizierter und transplantierter Chondrozyten stimuliert die Knorpelreparatur in vivo. Obwohl rAAV-Vektoren einen direkten und effizienten Gentransfer in Chondrozyten und Knorpel erlauben, existierte bislang kein potenter rAAV-hIGF-I-Vektor. Wir testeten die Hypothese, daß nach Konstruktion eines rAAV-hIGF-I-Vektors die Überexpression von IGF-I die proliferativen und metabolischen Eigenschaften der Chondrozyten stimuliert.
Methodik: Eine humane IGF-I cDNS wurde in rAAV kloniert (rAAV-hIGF-I). Primäre humane normale und arthrotische Chondrozyten wurden durch rAAV transduziert, in Alginatsphäroide verkapselt und anschließend wurden die Transgenexpression (IGF-I-ELISA) und die Zellviabilität analysiert. Der DNS-, Proteoglykan- und Typ-II-Kollagengehalt wurde mittels Hoechst 33258, DMMB und ELISA bestimmt, histologische Analysen wurden an Hematoxylin-Eosin gefärbten Paraffinschnitten der Alginatsphäroide 26 Tage nach Transduktion durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Eine effiziente IGF-I-Überexpression über einen Zeitraum von mindestens 26 Tagen resultierte nach rAAV-hIGF-I-Gentransfer in verkapselten humanen normalen und arthrotischen Chondrozyten. Überexpression von hIGF-I durch rAAV in Sphäroiden mit normalen und arthrotischen Chondrozyten führte zu einer signifikanten, bis zu 1,2-fach gesteigerten Zunahme vitaler Zellen im Verlauf der Studie, wohingegen die Anzahl vitaler Zellen signifikant um das 4,3-fache in den Kontrollsphäroiden im Vergleich zu IGF-Sphäroiden abnahm. Die Viabilität beider Typen von IGF-Sphäroiden lag mit 98–100% nach 26 Tagen etwa 40% über der beider Typen von Kontrollsphäroiden (initial 90–100%). Die durch IGF-I erhöhte Zellviabilität und Zellteilungsrate wurde durch Analysen der Zelldichte auf histologischen Schnitten von Sphäroiden sowie durch Bestimmung des DNS-Gehalts (bis zu 27-facher Anstieg; P≤0,001) bestätigt (z.B.: DNS-Gehalt arthrotische Zellen: 2,73±0,11 μg/104 lebende Zellen versus Kontrollzellen: 0,10±0,01 μg/104 lebende Zellen). Der Proteoglykangehalt war in den rAAV-hIGF-I-transduzierten Sphäroiden um das bis zu 3,6-fache, der Typ-II-Kollagengehalt um das bis zu 6,8-fache gegenüber den Kontrollen erhöht. In den Kontrollen nahmen diese Parameter im Laufe der Studie ab.
Die Daten zeigen, daß es möglich ist, einen funktionellen rAAV-hIGF-I-Vektor zu klonieren. Die Daten zeigen weiterhin, daß eine rAAV-vermittelte Überexpression von IGF-I signifikant die Zellproliferation von humanen normalen und arthrotischen Chondrozyten stimuliert. Die IGF-I-Überexpression steigert ebenfalls simultan die Synthese der beiden wichtigen Matrixbestandteile Proteoglykan und Typ-II-Kollagen. Weitergehende Studien müssen den therapeutischen Nutzen von rAAV-hIGF-I für die Knorpelreparatur in vivo evaluieren.