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Optimierter nichtviraler Gentransfer in humane mesenchymale Stammzellen
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Authors
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H. Madry
- Universitätskliniken des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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S. Elsler
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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D.-M. Kohn
- Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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M. Cucchiarini
- Labor für Experimentelle Orthopädie, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
| Published: | October 15, 2009 |
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Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) sind eine wichtige Zielzellpopulation für genbasierte Ansätze zur Knorpelreparatur. Wir untersuchten 15 verschiedene nichtvirale Transfektionssysteme auf ihre Fähigkeit zum Gentransfer in hMSC.
Methodik: MSC wurden aus Knochenmarkaspiraten von Patienten während der Implantation von Kniegelenkendoprothesen unter Standardbedingungen isoliert, charakterisiert (CD44, CD31, CD34, CD71, CD105) und in MesenCult® kultiviert. Transfektionen mit dem Luziferase-Expressionsvektor pCMVluc unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers fanden bei Passage 1–2 mit folgenden Transfersystemen statt (ugDNS/ul Reagenz): FuGENE6 (Roche; 0,25/0,5), Metafectene (Biontex; 0,125/0,625), Lipofectamine 2000 (Invitrogen; 0,2/0,5), Dreamfect (Oz Bioscience; 0,125/0,5), GeneJammer (Stratagene; 0,25/0,75), Effectene (Qiagen; 0,05/1,25), Turbofectin (OriGene; 0,05/0,15), Mirus (Mirus BioCorporation; 0,1/0,28), LipofectaminPLUS (Invitrogen; 0,1/0,3), Gene Juice (Novagen; 0,06/0,2), DreamfectGold (Oz Bioscience; 0,25/1), Transpass D2 (New England Biolabs; 0,1/0,2), Jet Pei (Polyplus Transfection; 0,25/0,5), Ecotransfect (Oz Bioscience; 0,2/0,4), DMRIE-C (Invitrogen; 0,06/0,18). Vor (12 h) und während der Transfektion fand eine zusätzliche Inkubation mit Hyaluronidase statt (4 U/ml) (Sigma). Die Transgenexpression wurde 2 Tage später durch Luziferaseaktivität und Normalisierung auf Proteingehalt (BCA; Thermo Scientific) ermittelt (RLU/mg Gesamtprotein). Die Zytotoxizität wurde über Lactatdehydrogenase bestimmt (Cytotoxicity Detection Kit; Roche). Die Daten sind ausgedrückt als % Zytotoxizität. Jede Kondition (n=2) wurde in drei unabhängigen Experimenten überprüft. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Der Mann-Whitney-Rank-Sum-Test bestimmte die Signifikanz.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: GeneJammer erzielte die maximale Luziferaseaktivität in hMSC von allen 15 getesteten Systemen (11053±7872 RLU/mg Gesamtprotein). Inkubation mit 4 U/ml Hyaluronidase steigerte die Transgenexpression um das 1,4-fache auf 15356±11001 RLU/mg Gesamtprotein (P=0.454). Die Werte der Transfektionssysteme lagen zwischen 1382±719 (DMRIE-C) und 6798±2315 RLU/mg Gesamtprotein (Ecotransfect) ohne Hyaluronidasebehandlung und zwischen 1080±625 (FuGENE6) und 7437±3307 RLU/mg Gesamtprotein (Mirus) mit Hyaluronidasebehandlung. Interessanterweise war Gene Jammer auch unter den am wenigsten toxischen Transfektionssystemen, die in dieser Studie getestet wurden. Transfektion von hMSC mit GeneJammer resultierte in einer Toxizität von 13,76%±3,35%, während die gemessenen Toxizitäten der anderen 14 Systeme maximal 47,41%±2,19% (DreamfectGold) erreichten.
Zusammenfassend vermitteln nichtvirale Transfektionssysteme einen erfolgreichen Gentransfer in hMSC. Diese Ergebnisse könnten zur nichtviralen Modifizierung von hMSC zu Fragen der Knorpelregeneration verwendet werden. (Abbildung 1 [Abb. 1])
