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Fragestellung: Hypoxie stellt in ihrer chronischen Form eine wesentliche Komplikation bei der humanen Weichteilregeneration dar und ist vor dem Hintergrund der Herstellung eines autologen Gewebeersatzes zur Behandlung chronischer Wunden im Rahmen des Tissue Engineering ebenfalls als kritisch anzusehen. Es ist daher von zentraler Bedeutung, Grundlagen der Hypoxieantwort von, für die Weichteilregeneration relevanten Zelltypen wie humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) und normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHDF), zu erarbeiten.

In einem neuen in vitro-Wundheilungsassay (co-culture scratch-wound migration assay = CCSWMA) wurde in der vorliegenden Studie überprüft, wie Hypoxie die o.g. Zellen beeinflusst. Im Weiteren wurde untersucht, ob Erythropoietin (EPO), als bekannter Modulator der Endothelzellaktivität, in der Lage ist, die Hypoxieantwort zu verändern.

Methodik: Objektträgerkulturen in Form von HDMEC- und NHDF-Mono- (je n = 4) und -Co-Kulturen (n = 5) wurden nach unterschiedlichen Stimuli und Versuchszeiten fixiert und der Mediumüberstand gesammelt (Zeitpunkte (Stimuli): 0 h, 24 h (Normoxie = N), 24 h (Hypoxie = H (pO25mmHg)), 24 h (N/EPO (5IU/ml)), 24 h (H/EPO), 48 h (N), 48 h (N/EPO)). Die Visualisierung der einzelnen Zelltypen nach immunzytochemischer Fluoreszenzfärbung mit Hilfe der Antikörper gegen von Willebrand factor (HDMEC) und extra domain A fibronectin (NHDF) diente der Beschreibung der Zellinteraktion und der Quantifizierung der Proliferation zu den jeweiligen Zeitpunkten. Die Migration der Zellen in die in vitro-Wunde wurde mikroskopisch quantifiziert. Auf Unterschiede in den Gruppen (Signifikanzniveau p 0,05) wurde getestet mittels ANOVA und Holm-Sidak-Test. Die Freisetzung von VEGF (vascular endothelial cell growth factor) und Angiogenin ins Medium wurde über einen Cytometric Bead Array bestimmt.

Ergebnisse: Unter Hypoxie kam es zur Abnahme der Proliferation sowohl in den Mono- als auch in den Co-Kulturen (HDMEC: H: 52 [Zellen/mm²], N: 109; NHDF: H: 217, N: 478). Ebenso verursachte die Hypoxie die erhöhte Freisetzung von VEGF (HDMEC: H: 313 [pg/106Zellen], N: 120; NHDF: H: 6800, N: 460) und Angiogenin (HDMEC: H: 183 [pg/106Zellen], N: 104; NHDF: H: 300, N: 60). Bezüglich der Proliferation zeigte sich kein signifikanter Einfluss von EPO. Während die Migration der Zellen nach Hypoxie in Co-Kultur signifikant gehemmt wurde und die in vitro-Wunde zu 26,26% geschlossen war (N: 58,80%), zeigte sich unter EPO-Gabe nur noch eine schwache und nicht mehr signifikante Abschwächung der Migration (H: 33,08%, N: 47,09%), was auf einen protektiven Effekt von EPO während der Hypoxie schließen lässt.

Schlussfolgerungen: In zukünftigen Studien sollte daher überprüft werden, ob der Einsatz von EPO im Rahmen der Zellkultivierung dreidimensionaler Gewebekonstrukte –insbesondere immer dann, wenn zusätzlich Endothelzellen verwendet werden – die durch Hypoxie verursachten Schäden im Innern der Konstrukte relativieren kann.