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Stimulation der in situ Zellproliferation im humanen VKB durch rAAV-vermittelte Überexpression von FGF-2
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Authors
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M. Cucchiarini
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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A. Weimer
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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S. Schetting
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
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C. Ma
- Harvard University, Boston, United States of America
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E. Terwilliger
- Harvard Institutes of Medicine, Boston, United States of America
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D.-M. Kohn
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
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H. Madry
- Universitätsklinikum des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
| Published: | October 16, 2008 |
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Fragestellung: Der Transfer von therapeutischen Genen in Ligamente kann zur Modulierung der Heilung dieses Gewebes verwendet werden. Wir zeigten bereits, daß rAAV-Vektoren Markergene in humane Fibroblasten des vorderen Kreuzbandes (VKB) in vitro und in situ, und auch ins lapine ACL in vivo einschleusen können. Wir untersuchten in dieser Studie die Hypothese, daß die Überexpression von FGF-2 durch rAAV zu meßbaren metabolischen Veränderungen in humanen ACL-Explantat-Kulturen in situ führt.
Methodik: Als Vektoren wurden rAAV-lacZ und rAAV-hFGF-2 verwendet und nach beschriebenen Protokollen verkapselt, aufgereinigt und titriert. Humane VKB-Explantate wurden mit 40µl rAAV tranzduziert und für 19 Tage kultiviert. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. Per Immunfärbung wurde β-gal, FGF-2 und Typ-I- und Typ-II-Kollagen detektiert. Die FGF-2-Expression wurde weiterhin mittels ELISA untersucht. Morphometrische Messungen wurden an 3 standardisierten Seiten der Explantatoberfläche mit Hilfe eines Bildanalyse-Programms durchgeführt und ausgewertet. Der DNS-Gehalt wurde durch einen fluorimetrischen Assay und der Gehalt von Typ-I- und Typ-II-Kollagen mittels ELISA manifestiert. Die Daten wurden geblindet von zwei individuellen Personen erhoben. Jede Kondition (n=2) wurde in zwei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt (T-Test, Mann-Whitney Rangsummen-Test).
Ergebnisse: Eine effiziente und nachhaltige Transgenexpression in rAAV-lacZ-transduzierten Proben zeigte sich durch Nachweis der β-gal-Aktivität bis zum 19. Tag, dem Ende der Experimente. Die gemessenen Transduktionseffizienzen betrugen 80 bis 85%. Die Sekretion von FGF-2 in rAAV-hFGF-2-transduzierten (behandelten) VKB-Explantaten betrug 33,0 ± 0,82 pg/ml/24 h im Vergleich zu den 1,25 ± 0,50 pg/ml/24 h der Kontrollexplantaten am 19. Tag. Auf immunhistochemisch gefärbten Schnitten zeigte sich eine spezifische Aktivität im gesamten VKB-Gewebe. Kein Unterschied zeigte sich im Gehalt von Typ-I- und Typ-II-Kollagen zwischen behandelten und Kontroll-VKB-Explantaten (P ≥ 0.4), sowohl mittels biochemischer als auch histomophometrischer Analyse (P ≥ 0.228). Eine signifikant höhere Zelldichte und Zellzahl, ausgedrückt als DNS-Gehalt, lag in mit rAAV-hFGF-2-behandelten VKB-Explantaten im Vergleich zu in Kontroll-Explantaten vor (P ≤ 0.029). Diese Veränderungen waren im gesamten Gewebe des VKB nachweisbar.
Schlussfolgerungen: Die Daten zeigen, daß humaner FGF-2 in humanen VKB-Explantaten effizient mittels rAAV in situ und über einen längeren Zeitraum überexprimiert werden kann. Diese Überexpression steigert signifikant die Zellproliferation im VKB. Diese Ergebnisse können eine Basis für neue Behandlungsmöglichkeiten in der Kreuzbandchirurgie bilden, wenn das therapeutische Ziel die Stimulierung der Zellproliferation ist.
