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Immobilisierter Transforming Growth Factor beta 1 induziert die Differenzierung von normalen humanen dermalen Fibroblasten zu Myofibroblasten
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Authors
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W. Metzger
- Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Homburg, Germany
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N. Grenner
- Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Homburg, Germany
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R. Strehlow
- Fraunhofer Institut, Insititut für Biomedizinische Technik, Potsdam-Golm, Germany
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T. Pohlemann
- Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Homburg, Germany
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M. Oberringer
- Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Homburg, Germany
| Published: | October 9, 2007 |
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Fragestellung: Im Forschungsverbund „Cellprom“ wird untersucht, ob Zellen durch den Kontakt mit nanoskalig modifizierten Oberflächen zur Differenzierung angeregt werden können. Transforming Growth Factor beta 1 (TGF β1) wurde als Induktor der myofibroblastoiden (MF) Differenzierung kovalent an funktionalisierte Objektträger und an reaktive Nanopartikel gebunden. Die TGF β1-Nanopartikel wurden auf Objektträgern angeordnet. Die differenzierende Wirkung der TGF β1-Oberflächen wurde in Zellkulturversuchen mit normalen humanen dermalen Fibroblasten (NHDF) untersucht.
Methodik: Substrate für die Immobilisierung von TGF b1 (c=5 µg/ml) waren Aldehyd-, Epoxy- und Amino-Objektträger. Die Inkubationsdauer betrug je nach Oberfläche 1-2 h. Persistierende Reaktivgruppen wurden mit Zellkulturmedium geblockt. Um TGF β1 an Aminogruppen zu koppeln, mussten die Carboxylgruppen zuvor mit Carbodiimid aktiviert werden.
Reaktive Nanopartikel wurden mit TGF β1 bzw. BSA beschichtet (c = 50 µg/ml) und mittels eines Nanoplotters auf Glas-Objektträgern angeordnet. Der Erfolg der Immobilisierung wurde immunologisch überprüft. NHDF wurden mit einer Dichte von 63 Zellen/mm2 ausgesät und 2 Tage inkubiert. Nach Immunfloureszenzfärbung des MF-Markerproteins α-smooth-muscle actin (α-SMA) konnte mikroskopisch der Anteil der MF an der Gesamtzellzahl bestimmt werden. Zur statistischen Absicherung wurde ein t-Test für Paardifferenzen durchgeführt (p<0,05).
Ergebnisse: Für die Aldehyhd- und Epoxy-Objektträger und die Nanopartikel konnte der Erfolg der TGF β1-Immobilisierung immunologisch gezeigt werden. Die Stabilität der adsorbierten TGF β1-Nanopartikel unter Zellkultur-Bedingungen war gegeben. Für die Aldehyd-Objektträger konnte ein Anstieg der Differenzierungsrate gegenüber der Kontrolle von 6,4% (Hersteller 1, n=6) bzw. 9,4% (Hersteller 2, n=5) beobachtet werden. Bei Verwendung von Amino-Objektträgern wurde kein Anstieg der Differenzierungsrate beobachtet (n=6). Im Vergleich zu den BSA-Nanobeadscapes stieg die Differenzierungsrate auf den TGF β1-Nanobeadscapes um 6,3% (n=8). Gegenüber einem Objektträger ohne Beads stieg die Differenzierungsrate auf den BSA-Beadscapes um 8,6% (n=8).
Schlussfolgerung: Es ist möglich, TGF β1 auf Aldehyd- und Epoxy-Objektträgern zu immobilisieren und nachzuweisen. Die signifikante Steigerung der Differenzierungsrate auf den beschichteten Bereichen kann als Beweis für die Aktivität des TGF β1 gesehen werden. Auf reaktiven Nanopartikeln konnte TGF β1 ebenfalls immobilisiert und nachgewiesen werden und führte zu einer signifikanten Steigerung der Differenzierungsrate gegenüber den Kontrollpartikeln mit BSA.
Die gesteigerte MF Differenzierungsrate auf den BSA-Nanopartikeln im Vergleich zum Objektträger könnte in der Topographie der Partikel begründet sein.
Die Ergebnisse zeigen die Eignung der Nanopartikel zur Zelldifferenzierung in vitro und erlauben in Zukunft die definierte räumliche und zeitliche Anwendung mehrerer relevanter Faktoren.
