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Fragestellung: Der Einsatz in vitro amplifizierter humaner artikulärer Chondrozyten (HAC) zur Rekonstruktion von Knorpeldefekten ist ein erfolgversprechender experimenteller Therapieansatz. Die Expansion von HAC in Monolayerkultur ist jedoch mit einem sukzessiven Verlust an Syntheseleistung für knorpelspezifische Matrixproteine verbunden (Dedifferenzierung). Für das Rekonstruktionsergebnis ist daher ihre Redifferenzierung in funktionelle Knorpelzellen von zentraler Bedeutung. Ziel der vorliegenden Untersuchung ist die Beschreibung des Einflusses von Stickstoffmonoxid (NO) auf das Redifferenzierungsverhalten expandierter HAC in einem in vitro-Modell.

Methodik: HAC wurden, im Anschluss an die chirurgische Versorgung von Schenkelhalsfrakturen mittels Endoprothese, unter standardisierten Bedingungen aus Gelenkknorpel von Femurköpfen isoliert. Es folgte eine 3-wöchige Expansion dieser Zellen in Monolayerkultur. Je 250.000 der so angezüchteten HAC wurden anschließend zu dichten Zellpellets zentrifugiert und für 3 Wochen in einem chondrogenen Differenzierungsmedium rekultiviert. Die Kontrolle der NOS-Aktivität erfolgte über den Nachweis von Nitrit im zellfreien Kulturüberstand der Pellets anhand der sog. Griess-Reaktion. RT-PCR Untersuchungen (nNOS, iNOS, eNOS, Aggrecan, Kollagen I und II sowie GAPDH) wurden nach 1, 7, 14 und 21 Tagen durchgeführt. Eine Gruppe von Zellpellets wurde in Standard-Differenzierungsmedium kultiviert (Kontrolle). In verschiedenen Testgruppen wurde der Einfluss von IL-1β, TNFα, des NO-Donors Deta-Nonoate sowie des NOS-Inhibitors N-Amino-L-Arginine (L-NAA) auf das Redifferenzierungsverhalten untersucht.

Ergebnisse: Histochemische (Alzian Blau), immunhistochemische (Kollagen II) sowie RT-PCR Untersuchungen (Kollagen I und II, Aggrecan) wurden nach 7, 14 und 21 Tagen durchgeführt und zeigten eine Redifferenzierung der expandierten HAC. Die mit IL-1β bzw. TNFα inkubierten Pellets wiesen eine, im Vgl. zu Kontrollen deutlich höhere Expression der iNOS sowie eine geringere Expression von Kollagen Typ II und Aggrecan auf. Bei simultaner Zugabe von IL-1β bzw. TNFα und dem L-NAA war dieser Effekt zumindest teilweise reversibel. Unter dem alleinigen Einfluß von L-NAA redifferenzierte Zellen zeigten eine im Vergleich zur Kontrolle frühere Expression der knorpelspezifischen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan.

Schlussfolgerungen: Das verwendete Zellkulturmodell erlaubt die in vitro-Untersuchung der Redifferenzierung expandierter HAC unter standardisierten Kultur- und Testbedingungen. Die Stimulation der endogenen NO-Synthese mit IL1ß oder TNFα führte im Modell zu einer Abnahme der Genexpression wichtiger Matrixproteine des hyalinen Gelenkknorpels. Dieser Effekt wird zumindest teilweise über NO vermittelt. Die Inhibition der NOS hat einen positiven Einfluß auf das Redifferenzierung der Zellen.