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Einfluss von zyklischer mechanischer Dehnung und Dexamethason auf die osteogene Differenzierung von humanen stromalen Knochenmarkzellen
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Published: | November 11, 2003 |
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Fragestellung
Dexamethason ist ein etablierter osteogener Differenzierungsfaktor für humane stromale Zellen aus dem Knochenmark (hBMSC), die Wirkung von zyklischem Dehnungsstress hingegen unzureichend erforscht. Ziel dieser Untersuchung war die vergleichende Untersuchung von Dexamethason und zyklischer mechanischer Dehnung als potentiellen osteogenen Differenzierungsfaktoren auf hBMSC.
Methoden
hBMSC von 6 Spendern wurden aus dem Beckenkamm von 32.5+-6.2 Jahre alten Patienten entnommen. Die Zellen wurden aufgearbeitet und in vitro in einem Standard Medium kultiviert und nach Erreichen von Konfluenz passagiert. Nach der 2.-3. Passage, wurden 2.5 * 10^5 Zellen auf flexible Silikonschalen ausgesät. Die Schalen wurden in 6 Gruppen unterteilt: In Gruppe 1-3 wurde 125 µl/ 500 ml Dexamethason dem Standardmedium zugefügt (D+). Gruppen 4-6 wurden ohne Dexamethason kultiviert (D-). 4 Gruppen wurden je 3 Wiederholungen von 2 Stunden zyklischer mechanischer Dehnung ausgesetzt. Die Gruppen 1 und 4 wurden 2% Dehung (D+2; D-2) und die Gruppen 2 und 5 8% Dehnung (D+8; D-8) bei einer Frequenz von 1 Hz ausgesetzt. Die Ruhephase dauerte 21 Stunden. Gruppe 3 und 6 wurden ohne mechanische Dehnung als Kontrollgruppen kultiviert (D+0; D-0). Stimulierte und nicht stimulierten Zellkulturen wurden am 1. und 4. Tag nach der Stimulation (d4, d7) von den Schalen abgelöst, homogenisiert, und der Proteingehalt nach Lowry, sowie die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) bestimmt. Osteocalcin (OC) wurde mittels enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA) analysiert. Der Gehalt an mRNA von Kollagen 1 und 3 wurde mittels RT-PCR bestimmt.
Ergebnisse
Der Vergleich der relativen Aktivität der AP zeigte nach 7 Tagen signifikant mehr AP Sekretion bei den Zellen, die 8% Dehnung ausgesetzt waren. Die Werte für 2% und die Kontrollen waren nicht signifikant erhöht (D+8: 0.49+/-0.17; D-8: 0.54+/-0.17; D+2: 0.42+/-0.09; D-2: 0.35+/-0.13; D+0: 0.40+/-0.09; D-0: 0.36+/-0.09 U/l/µg Protein; p<0.05). Die RT-PCR zeigte nur in der 8% mit Dexamethason kultivierten Gruppe einen signifikanten Anstieg des Kollagen 1 (bezogen auf GAPDH: D+8: 1,16+/-,54; D-8: 1,13+/-0.76; D+2: 0,61+/-0,12; D-2: 0,60+/-0,21; D+0: 0,52+/-0,38; D-0: 0,66+/-0,18) und Kollagen 3 (D+8: 0,92+/-,13; D-8: 0,94+/-0.10; D+2: 0,64+/-0,06; D-2: 0,58+/-0,33; D+0: 0,46+/-0,43; D-0: 0,68+/-0,30) mRNA Gehalts der Proben. Die Multivariate Analyse der Effekte zeigte einen 10 fach stärkeren Effekt der zyklischen Dehnung im Vergleich zu Dexamethason (F=3,02;p<0,01 bzw. F=0,30). In der ELISA Untersuchung konnte kein OC im untersuchten Zeitintervall nachgewiesen werden.
Schlussfolgerungen
8% zyklische Dehnung in Silikonschalen steigerte signifikant die AP-Expression im Vergleich zu 2% Dehnung und den Kontrollen. Zyklische Dehnung steigert die osteogene Differenzierung der BMSC in vitro im Vergleich zu Dexamethason signifikant stärker.