gms | German Medical Science

Einleitung/Ziel: Die Regenerationseffizienz kann durch gezielte Zugabe bioaktiver Moleküle gesteigert werden. Als wichtiges Enzym in der Regeneration des mexikanischen Axolotl (Ambystoma mexicanum), einem Amphibium mit außergewöhnlicher Regenerationsleistung, konnte die epidermale Lipoxygenase (AmbLOXe) identifiziert werden. AmbLOXe hat einen positiven Einfluss auf Zellproliferation und Migration. Ziel dieser Studie war, diesen Faktor in Fettstammzellen (ASC) einzubringen. Da ASC mit den üblichen Methoden schwer transfizierbar sind, wurde die Nukleofektion gewählt. Es ist bekannt, dass Stammzellen die Regeneration von Geweben günstig beeinflussen. In der Kombination Stammzelle und Regenerationsfaktor hoffen wir diesen Effekt zu optimieren.

Material/Methode: Für die Nukleofektion wurde AmbLOXe in den Vektor pIRES-EGFP kloniert. Die aus inguinalem Fettgewebe der Ratte isolierten ASC wurden in Passage 1 unter Verwendung des Nucleofector^® 2b und dem hMSC Nucleofector Kit (Lonza) transfiziert. Die Transfektion wurde mittels PCR und Bestimmung der Transfektionsrate (Durchflusszytometrie) überprüft. Um eine Aussage über die Regenerationsleistung der transfizierten Zellen treffen zu können, fand als einfacher in vitro Test der Scratch Assay Verwendung. Dabei wurde 3 Tage nach Nukleofektion ein konfluenter ASC-Zellrasen mittels einer Pipettenspitze „gescratcht“ und bis zu dessen Verschluss fotografisch dokumentiert. Die Auswertung erfolgte über die bildanalytische Vermessung der noch nicht bewachsenen Flächen.

Ergebnisse: Die ASC ließen sich über die Nukleofektion mit AmbLOXe transfizieren. Am Tag 3 nach der Nukleofektion lag die Transfektionsrate bei durchschnittlich 85%. Die Transfektion war nicht stabil, mit zunehmender Passage der transfizierten Zellen nahm die Transfektionsrate ab und lag nach viermaligem Passagieren bei 3,9%. Das Genprodukt konnte mittels PCR nachgewiesen werden. Der Scratch Test erbrachte keine signifikanten Unterschiede zwischen den AmbLOXe transfizierten Zellen und Zellen die mit dem Leervektor bzw. ohne DNA transfiziert wurden.

Diskussion: Die ASC konnten über die Nukleofektion transient mit AmbLOXe transfiziert werden. Trotz der hohen Transfektionseffizienz war im Scratch Test keine verbesserte Regenerationsfähigkeit der ASC nachweisbar, ein Effekt, der zum Beispiel für die humane Keratinozyten-Zelllinie HaCaT bekannt ist. Das schließt jedoch nicht aus, dass die mit AmbLOXe transfizierten ASC bei anderen Zelltypen eine Regenerationsförderung bewirken können, was Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein soll.