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Hintergrund: Wichtige Parameter für einen erfolgreichen gentherapeutischen Ansatz sind das effiziente Einbringen des therapeutischen Gens in die entsprechenden Zellen, dessen langanhaltende Expression sowie die Minimierung von möglichen Nebeneffekten. Das Sleeping Beauty Transposon System (SB100X) erfüllt die genannten Kriterien und erlaubt den stabilen Gentransfer in verschiedene Primärzelltypen. Wir postulieren, dass im Fall der neovaskulären AMD, die durch ein Ungleichgewicht des provaskulären VEGF und des antiangiogenen PEDF gekennzeichnet ist, die Neovaskularisation durch einen erhöhten PEDF Spiegel gehemmt und dadurch die Sehkraft verbessert werden kann. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die SB100X-vermittelte, stabile Transfektion von primären Pigmentepithelzellen mit dem PEDF Gen und deren subretinale Transplantation umfasst.

Methoden: Pigmentepithelzellen wurden mit zwei Plasmiden, die für das SB100X Transposase Gen bzw. das PEDF Gen kodieren, elektroporiert. Die Stabilität der PEDF Expression sowie dessen genomische Integration wurden mittels RT-PCR analysiert. Die kontinuierliche PEDF Sezernierung wurde durch Immunoblots nachgewiesen.

Ergebnisse: Die effiziente Transposition von 10.000 Zellen wurde in 5 unabhängigen Experimenten pro Zelltyp nachgewiesen. Das PEDF Transgen wurde ins Genom der Zielzellen integriert und rekombinantes PEDF wurde kontinuierlich über einen Zeitraum von länger als einem Jahr sezerniert.

Schlussfolgerungen: SB100X ermöglicht die stabile Integration und langanhaltende Expression des PEDF Gens in primären Pigmentepithelzellen. Die nachfolgenden Schritte zur Optimierung dieses Protokolls umfassen den Einsatz von mRNA, um eine mögliche genomische Integration des SB100X Transposase Gens auszuschließen, die gerichtete Integration des PEDF Transgens in nicht-kodierende Abschnitte des Genoms sowie die Etablierung der autologen Zellisolation, Transfektion und subretinalen Transplantation während einer einzigen Operationssitzung.