Artikel
Effizienter und Stabiler PEDF Gentransfer in primäre Pigmentepithelzellen mittels Sleeping Beauty Transposition
Suche in Medline nach
Autoren
Veröffentlicht: | 15. Juni 2011 |
---|
Gliederung
Text
Hintergrund: Die subretinale Transplantation von Pigmentepithelzellen zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen erzielte keine funktionelle Verbesserung. Ein möglicher Erklärungsansatz besteht darin, dass die transplantierten Zellen zu geringe Konzentrationen entsprechender Wachstumsfaktoren sezernieren, die für den Erhalt einer gesunden Umgebung wichtig sind. Aus diesem Grund haben wir den nicht-viralen Transfer des anti-angiogen und neurotroph wirkenden Faktors PEDF entwickelt, wobei das PEDF Gen mit Hilfe des hyperaktiven Sleeping Beauty (SB100X) Transposonsystems, das eine effiziente und stabile Insertion ermöglicht, in primäre Pigmentepithelzellen eingebracht wurde.
Methoden: Mittels Elektroporation wurden ARPE-19 und primäre Pigmentepithelzellen mit einem Kontroll- oder einem PEDF-kodierenden Plasmid transfiziert, die entweder unter der Kontrolle eines CMV oder CAG Promotors standen. Die Transfektionseffizienz und die Stabilität der Proteinexpression wurden mittels Durchflusszytometrie und durch Immunoblots nachgewiesen.
Ergebnisse: Die SB100X-basierte Transposition resultierte in Effizienzen von 100% mit dem Kontrollplasmid und 40% mit dem PEDF-kodierenden Plasmid. Die nachfolgende Sortierung der PEDF-transfizierten Zellen ermöglichte die Etablierung von annähernd reinen Population positiver Zellen. In allen Zelltypen wird die PEDF Sezernierung bis zum jetzigen Zeitpunkt für 8 Monate gehalten; jedoch resultierte die CAG-kontrollierte Expression in einer niedrigeren PEDF Sezernierung als die des entsprechenden CMV-kontrollierten Plasmids.
Schlussfolgerungen: Mit Hilfe des SB100X Systems konnte der bislang limitierte nicht-virale Transfer für den gentherapeutischen Einsatz verbessert werden. Wir haben gezeigt, dass der SB100X-basierte Gentransfer die stabile Expression und kontinuierliche PEDF Sezernierung in Primärpigmentepithelzellen gewährleistet. Diese, im Gegensatz zum retroviralen Gentransfer, komplikationsfreie Transgenintegration ins Zellgenom ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung einer zellbasierten, nicht-viralen Genadditionstherapie zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen.