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Ziel: Erhöhte Glukosekonzentrationen führen zu einer verminderten Expression von gap-junction Proteinen wie Connexin 43 (Cx43). Welchen Einfluss hat dies wiederum auf die Expression von tight-junction Proteinen, Occludin und ZO-1?

Methoden: Retinale Endothelzellen der Ratte wurden für 7 Tage entweder in normalem (N) Medium (5 mM) oder in einem Medium erhöhter Glukosenkonzentration (HG) (30 mM) gezüchtet. Im Stadium der Subkonfluenz wurden zwei Gruppen von Zellen des Medium N entweder mit Cx43 antisense-Oligonukleotiden (AS-Cx43 oligos) oder randomisierten Oligonukleotiden transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden zusammen mit den im Medium N und Medium HG gewachsenen Zellen 72 Stunden nach der Transfektion analysiert. Die Expression von Cx43, Occludin und ZO-1 wurde mittels Western-Blot bestimmt. Um zu klären, ob eine durch Erhöhung der Glukosekonzentration induzierte Minderexpression von Cx43 die Verteilung und Lokalisation von Occludin und ZO-1 beeinflusst, wurden Cx43, Occludin und ZO-1 in an Objektträgern gewachsenen Zellen mittels Immunfluoreszenz dargestellt.

Ergebnisse: Die Western-Blot-Analyse bestätigte eine signifikante Reduktion der Cx43 Expression in Zellen, die mit AS-Cx43-oligos transfiziert wurden im Vergleich zu den normalen, nicht transfizierten Zellen (67,9±3,61% der Kontrolle, p<0.005). Zellen, die mit randomisierten Oligonukleotiden transfiziert wurden, zeigten keine wesentlichen Veränderungen. Die verminderte Cx43-Proteinexpression in den mit AS-Cx43-oligos transfizierten Zellen war ähnlich zu der von Zellen, die in erhöhter Glukosekonzentration gewachsen waren (54,3±9,7% der Kontrolle, p<0.0005). Ebenso war die Proteinexpression von Occludin und ZO-1 in den transfizierten Zellen verglichen mit den nicht-transfizierten Zellen aus dem normalen Medium vermindert (57,58±15,82% der Kontrolle, p<0.005; 75,18±7,68% der Kontrolle, p<0.005). Die verminderte Expression der tight-junction Proteine war auch ähnlich den Zellen aus dem Medium erhöhter Glukosekonzentration (61,49±19,4% der Kontrolle, p<0.05; 63±5,7% der Kontrolle, p<0.005). Die Immunfluoresenz für Cx43 in den mit AS-Cx43-oligos transfizierten Zellen war im Vergleich zu den nicht-transfizierten Zellen signifikant reduziert (68,24±15,92 der Kontrolle p<0.05). Die Zellen, die mit randomisierten Oligonukleotiden transfiziert wurden, zeigten keinen Unterschied. Die reduzierte Cx43-Immunfluoreszenz war ähnlich wie bei den HG-Zellen (61,4±4,8% der Kontrolle, p<0.0005). Die Immunfluoreszenz von Occludin und ZO-1 in den transfizierten Zellen war ebenfalls signifikant geringer verglichen mit den nicht transfizierten Zellen aus normalem Medium (62,5±14,84% der Kontrolle, p<0.005; 56,38±18,39% der Kontrolle, p<0.05). Die reduzierte Occludin- und ZO-1-Immunfluoreszenz war ähnlich der der HG-Zellen (62,8±6,4% der Kontrolle, p<0.005, 53,7±22,4% der Kontrolle, p<0.005).

Folgerung: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine durch erhöhte Glukosekonzentration induzierte Reduktion der Cx43-Expression wiederum zu einer Minderexpression von tight-junction Protein führt. Dies könnte zumindest teilweise die Beeinträchtigung der Blut-Retina Schranke, wie sie bei der diabetischen Retinopathie zu beobachten ist, erklären.