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Sleeping beauty-vermittlelte Transfektion von Pigmentepithelzellen mit dem PEDF-Gen mit mRNA als Transposasequelle
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Veröffentlicht: | 15. Juni 2011 |
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Hintergrund: Die Transplantation von autologen Pigmentepithelzellen, die rekombinantes PEDF exprimieren, in den subretinalen Raum, ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung von AMD. Das Sleeping Beauty Transposase System gewährleistet eine stabile Transgeninsertion und kontinuierliche Proteinsezernierung. Allerdings besitzt das Transposase-kodierende DNA-Molekül das Potential, spontan ins Genom zu integrieren. Die Integration sowie die weitere Expression der Transposase kann zur Mobilisation und zur Neuintegration des Transposons führen. Um diese Gefahr zu umgehen, wurde Transposase-kodierende mRNA verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass diese Quelle der Transposase effektiv die Transposition in Pigmentepithelzellen herbeiführen kann.
Methoden: ARPE-19 Zellen wurden mit einem Kontrollplasmid oder einem PEDF-kodierenden Plasmid sowie mit SB100x-mRNA mittels Mikroporation ko-transfiziert. Die Transfektionseffizienz und die Proteinexpression wurden mittels Durchflusszytometrie und Western Blot analysiert.
Ergebnisse: ARPE-19 Zellen konnten stabil mit in vitro transkribierter mRNA als Quelle von SB100X transfiziert werden. Die Effizienz ist vergleichbar zu Transfektionen, bei denen SB100X-DNA verwendet wurde: mit dem Kontrollplasmid wurde 100% Transfektionseffizienz erreicht, mit dem PEDF-kodierenden Plasmid 60%. Seit bislang 50 Tagen (7 Passagen) zeigen die Kontrollplasmid-transfizierten Zellen Fluoreszenz und die PEDF-transfizierten Zellen sezernieren kontinuierlich PEDF ins Medium.
Schlussfolgerungen: mRNA ist eine effektive Alternative zu DANN als Quelle von SB100X, um ein Transgen in das Genom von Pigmentepithelzellen zu integrieren. Stabile Transfektion und langfristige Expression von PEDF von Zellen ist ein entscheidender Schritt für einen gentherapeutischen Ansatz zur Behandlung von AMD.