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Wir haben durch pronukleäre Mokroinjektion in fertilisierte Oozyten von Sprague-Dawley (SD)-Donoren transgene Rattenmodelle generiert, um die in vivo-Funktion des humanen Endothelinrezeptors Typ A (hETA) im glatten Gefäßmuskel zu untersuchen. Zur spezifischen Expression in glatten Gefäßmukelzellen wurde die hETA-cDNA unter die Kontrolle des murinen SM22alpha-Promotors gestellt.

Es wurden insgesamt 5 Founder identifiziert, von denen 4 transgene (tg) Linien abgeleitet wurden (L6351, L6353, L6878, L6888). Mittels RT-PCR wurde L6351 als transientes Expressionsmodell identifiziert (Downregulation der Expression des Transgens nach 1 Monat), während L6878 und L6888 eine länger anhaltende Expression auch noch nach 4 Monaten zeigten. L6353 zeigte nur eine minimale Expression. Vaskuläre Expression des Transgens wurde in den Linien L6351 und L6878 nachgewiesen, wobei die breite Organexpression in L6878 auf eine nicht gefäßmuskelspezifische Expression hindeutet. Mittels Real time-PCR (TaqMan 7000) unter Verwendung von SYBR Green wurde die relativen Kopienzahlen der integrierten tg Konstrukte bestimmt. Die höchste Kopienzahl wurde in L6351 gefunden (2- fach höher als in L6878 und 8-fach höher als in L6888). Basierend auf dieser Methode wurde ein Assay zur Diskrimierung homozygot tg Tiere entwickelt.

Mittels Real time PCR und unter Verwendung genspezifischer Sonden wurden die Transkriptkonzentrationen des tg hETA sowie des endogenen rETA und rETB, jeweils bezogen auf die 18S-Transkriptspiegel, bestimmt. In isolierten Mesenterialarterien waren die hETA-Transkripte in L6878 im Vergleich zu L6351 ca. 4-fach erhöht. Die Transkriptexpression verhielt sich somit invers zur Kopienzahl. Die endogene rETA mRNA war in Mesenterialarterien von L6351 um ca. 60% (p=0,09) vermindert, in L6878 hingegen nur geringfügig reduziert. Ähnliche Effekte zeigten sich bei Analyse der mRNA aus Aorta. Die endogene rETB mRNA war in L6351 um 40% vermindert (p<0,01), in L6878 nicht signifikant reduziert. Rezeptorbindungsstudien an Membranen iolierter Mesenterialarterien zeigten eine ca. 10-fach erhöhte ETA-Bindung in L6351 im Vergleich zu nicht tg Kontrollen. Unerwartet zeigte sich auch eine über 6-fach erhöhte ETB-Bindung. Die ETA- bzw. ETB-spezifische Bindung an Aortenmembranen war jedoch nur geringfügig erhöht!

Mithilfe von Genotyp- und Expressionsanalysen unserer transgenen Rattenmodelle des hETA haben wir nicht nur eine inverse Relation zwischen Kopienzahl und Transkriptmenge im spezifischen Zielgewebe identifiziert, sondern insbesondere auch gegenregulatorische Mechanismen auf Transkriptebene und eine Interaktion auf translationaler bzw. posttranslationaler Ebene nachgewiesen.