gms | German Medical Science

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012)

23.10. - 26.10.2012, Berlin

Unter Extrazellulären Matrix (ECM) Synthese-Bedingungen beeinflussen Scleraxis und E47 die DNA-Menge in humanen mesenchymalen Stammzellen

Meeting Abstract

  • presenting/speaker Sandra Noack - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany
  • Ramona Winkler - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany
  • Annika Hamm - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany
  • Michael Jagodzinski - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany
  • Christian Krettek - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany
  • Andrea Hoffmann - Klinik für Unfallchirurgie, Hannover, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012). Berlin, 23.-26.10.2012. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2012. DocPO12-497

DOI: 10.3205/12dkou533, URN: urn:nbn:de:0183-12dkou5336

Veröffentlicht: 2. Oktober 2012

© 2012 Noack et al.
Dieser Artikel ist ein Open Access-Artikel und steht unter den Creative Commons Lizenzbedingungen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.de). Er darf vervielfältigt, verbreitet und öffentlich zugänglich gemacht werden, vorausgesetzt dass Autor und Quelle genannt werden.


Gliederung

Text

Fragestellung: Eine beschleunigte Heilung von Sehnen- und Bändererkrankungen wäre ein wichtiger therapeutischer Fortschritt. Unter anderem kann eine veränderte Struktur oder Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix eine Ursache von Sehnen-Erkrankungen, z.B. von Tendinopathien, sein [1]. Wir entwickelten die Hypothese, dass die Überexpression des gewebespezifischen Transkriptionsfaktors Scleraxis zusammen mit ubiquitär exprimierten E2A-Proteinen (E12, E47) in mesenchymalen Stammzellen in vitro und in vivo die Ausbildung sehnen-ähnlicher Zellen und entsprechender Extrazellulärmatrix (ECM) vermitteln kann.

Methodik: Zur gentechnischen Veränderung von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) wurden konditional exprimierende Lentiviren eingesetzt und die Zellen einem sog. tendogenen Induktionsprotokoll unterzogen (50 µM Ascorbat-2-Phosphat, 10 mM Beta-Glycerophosphat, bis zu 21 Tage). Western Blots dienten zur Analyse der Proteinexpression. Genexpressionsanalysen erfolgten durch semiquantitative und quantitative realtime RT-PCR. Histologische Färbungen wurden zur Analyse der ECM durchgeführt. Der Nachweis von Glycosaminoglycanen erfolgte mit Dimethylmethylenblau. Der DNA-Gehalt wurde mit Bisbenzimid H33342 bestimmt.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Gene für Scx, E12 und E47 werden endogen in humanen MSCs synthetisiert. Scx-mRNA ist dabei generell zu einem deutlich geringeren Anteil vorhanden, während E12- und E47-mRNAs in ähnlicher Menge gebildet werden. Bei einzelnen Spendern sind die mRNA-Mengen unterschiedlich und sinken teilweise im Lauf der in vitro-Kultivierung der MSCs mit zunehmender Passagenzahl. Durch Lentiviren wurden Scx, E12 und E47 allein oder in Kombination in humane MSCs eingebracht. Safranin O-Färbungen waren nach Überexpression von E47 leicht und für die Kombination von Scx+E47 deutlich positiv, während in Kontrollmedium (ohne Zusätze) keine Färbung stattfand. Molekulare Basis hierfür könnte eine Geninduktion von sulfatierten Proteoglycanen sein, welche von Safranin O detektiert werden. Mit der biochemischen Methode zur Quantifizierung der Glycosaminoglycane konnte jedoch keine erhöhte Synthese von Glycosaminoglycanen detektiert werden. Die mRNA-Expression einer Reihe von Proteoglycanen blieb ebenfalls unverändert. Stattdessen konnte in den Scx+E47-überexprimierenden Zellen eine deutliche Erhöhung des DNA-Gehaltes nachgewiesen werden.

Schlussfolgerung: Die beobachteten Effekte sind von der Gabe von Ascorbat-2-Phosphat und Beta-Glycerophosphat abhängig, da sie in Kontrollmedium nicht auftraten. Die relativ spezifische Safranin O-Färbung bei Überexpression von Scx+E47 konnte jedoch nicht durch erhöhte Synthese von Proteoglycan-mRNAs erklärt werden, sondern scheint mit einer erhöhten DNA-Menge zusammenzuhängen, deren Ursache aktuell erforscht wird.


Literatur

1.
Parkinson J, et al. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2011;11:86-93.