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Fragestellung: Bei Patienten mit Polytrauma werden häufig Frakturheilungsstörungen beobachtet. Eine mögliche Ursache ist die systemische Entzündungsantwort, bei der das Komplementsystem, insbesondere die Anaphylatoxine C3a und C5a eine entscheidende Rolle spielen. Thema der vorliegenden Studie ist die Expression und die direkte, zellvermittelte Aktivierung des Komplementsystems durch Knochenzellen sowie der Einfluss von C3a und C5a auf die Bildung von Osteoklasten (OK).

Methodik: Humane primäre Osteoblasten (OB) und mesenchymale Stammzellen (MSC) sowie PBMNC wurden aus Operationsmaterial bzw. peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert. Die Analyse der Komplementexpression erfolgte mittels qRT-PCR aus Zelllysaten von OB nach 14 Tagen osteogener Differenzierung, MSC nach 0, 14, 21 und 28 Tagen osteogener Differenzierung, PBMNC sowie OC nach 14 und 21 Tagen Osteoklastogenese. Die Untersuchung der direkten Aktivierung der Komplementzymogene erfolgte nach 4h Inkubation von OB und OC mit C3 bzw. C5 durch Bestimmung der C3a bzw. C5a Konzentration im Zellkulturüberstand mittels ELISA. Die Aktivität des entstandenen C5a wurde mit einem Chemotaxis-Assay an neutrophilen Granulozyten bestimmt. Die Bestimmung der RANKL- und OPG-Expression in OB nach 24 h Co-Stimulation mit IL-1? und C3a bzw. C5a erfolgte mittels qRT-PCR. Als Positivkontrolle diente Lipopolysaccharid (LPS). Zur Untersuchung der Osteoklastogenese in Anwesenheit von C3a oder C5a wurde die Anzahl der TRAP positiven mehrkernigen Zellen nach 21 Tagen Osteoklastogenese in Ab- oder Anwesenheit von C3a bzw. C5a gezählt. Zur statistischen Analyse wurde ein Mann-Whitney U-test mit p<0,05 durchgeführt (n=3-7 Experimente).

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Undifferenzierte und osteogen differenzierte MSC und OB exprimierten die Komplementzymogene C3 und C5, während PBMNC nur geringe Mengen von C3 exprimierten. Während der Osteoklastogenese nahm die Expression von C3 zu. Sowohl OB als auch OC waren in der Lage C5 zu spalten. Dabei war die Menge des durch OC aktivierten C5a deutlich höher und konnte durch Zugabe von Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), einen Aktivator der Proteinkinase C, weiter gesteigert werden. Die Aktivität des gebildeten C5a konnte durch einen Migrations-Assay mit neutrophilen Granulozyten nachgewiesen werden. Eine Aktivierung von C3 durch OB oder OC wurde nicht beobachtet. Die Co-Stimulation von OB mit dem proinflammatorischen Interleukin IL-1? und C3a bzw. C5a bewirkte einen signifikanten Anstieg der Expression der beiden Cytokine RANKL und OPG, die für die Osteoklastogenese essentiell sind. In PBMC-Kulturen ohne RANKL und M CSF führte die Anwesenheit von C3a oder C5a zu einer signifikant erhöhten Osteoklastenzahl im Vergleich zur Kontrolle.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Knochenzellen in der Lage sind, die Komplementzymogene C3 und C5 zu exprimieren und C5 zu aktivieren. Aktive Komplementanaphylatoxine beeinflussen die Osteoklastogenese sowohl direkt als auch indirekt über die Induktion der RANKL- und OPG-Expression.