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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie, 75. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 97. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 52. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

25. - 28.10.2011, Berlin

Etablierung einer effektiven Markierungsmethodik von mesenchymalen Stammzellen für präklinische Untersuchungen von zellbesiedelten Implantaten

Meeting Abstract

  • B. Bischoff - Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Dresden, Germany
  • R. Hess - Technische Universität Dresden, Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Dresden, Germany
  • D. Scharnweber - Technische Universität Dresden, Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Dresden, Germany
  • A. Biewener - Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Dresden, Germany
  • H. Zwipp - Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Dresden, Germany
  • C. Rentsch - Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Dresden, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 75. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 97. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 52. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 25.-28.10.2011. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2011. DocPO16-742

DOI: 10.3205/11dkou628, URN: urn:nbn:de:0183-11dkou6289

Veröffentlicht: 18. Oktober 2011

© 2011 Bischoff et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Um die klinische Wirksamkeit zellbesiedelter Konstrukte in präklinischen Studien in vitro und in vivo besser untersuchen zu können, ist eine effektive und solide Markierung der verwendeten Zellen von Vorteil. Für eine schnelle und einfache Detektion dieser Zellen, finden Reporterproteine wie das green fluorescence protein (GFP) Anwendung.

In dieser Studie wurden zwei nicht-virale Transfektionsmethoden (Elektroporation und Lipofektion), zwei Vektoren (pEGFP-N1 und pCEP4eGFP) sowie Kultivierungsbedingungen mit und ohne Selektionsdruck hinsichtlich Transfektionseffizienz, Zellüberlebensrate und Plasmidretention untersucht. Ziel der Untersuchungen war, die bestmögliche Kombination aus Transfektionsmethode, Vektor und Kultivierungsbedingung zu ermitteln, um eine effektive Markierung von mesenchymalen Kaninchenstammzellen (rMSC) für geplante in vivo Studien zu etablieren.

Methodik: Die Elektroporation wurde mittels Nucleofection™ Kit und die Lipofektion mit Lipofectamin 2000 durchgeführt. Dabei wurden vergleichend die GFP-kodierenden Plasmide pEGFP-N1 und pCEP4eGFP verwendet. Die Transfektion von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) diente als Kontrolle. Nach der Transfektion wurden die Zellen sowohl in Selektionsmedium als auch im Standardmedium ohne Selektionsdruck über einen Zeitraum von 30 Tagen kultiviert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Proliferation auf die Plasmidretention der transfizierten Zellen untersucht.

Die Transfektionseffizienz und Überlebensrate wurde jeweils nach 24 h am Fluoreszenzmikroskop bestimmt und mittels ImageJ Software ausgewertet. Die Analyse der Plasmidretention erfolgte während des 30-tägigen Untersuchungszeitraumes über den Verlauf der Fluoreszenzintensität sowie über die Bestimmung der Anzahl GFP-positiver Zellen (GFP+).

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Transfektionseffizienz der Elektroporation war höher als die der Lipofektion. Für die Überlebensrate von hMSC und rMSC konnte kein signifikanter Unterschied in Abhängigkeit der verwendeten Transfektionsmethode festgestellt werden. Eine erhöhte Transfektionseffizienz mittels Elektroporation konnte bei der Verwendung von pEGFP-N1 (4733 bp) gegenüber pCEP4eGFP (10915 bp) bei beiden Spezies erreicht werden. Transfizierte Zellen, denen es nicht möglich war zu proliferieren oder die in Selektionsmedium kultiviert wurden, waren länger GFP+ als proliferierende Zellen und Zellen, die unter nicht-selektierenden Bedingungen kultiviert wurden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass rMSC länger und stärker GFP produzierten als hMSC.

Beide Transfektionsmethoden und Plasmide sind geeignet hMSC und rMSC zu transfizieren. Um ausschließlich markierte Zellen für die Implantatbesiedlung bereitzustellen, ist eine Kultivierung unter Selektionsdruck notwendig. Für eine effiziente und solide Markierung von hMSC und rMSC mit GFP wurde die Elektroporation mit pEGFP-N1 ausgewählt, um eine erste in vivo Pilotstudie am Kaninchenmodell durchzuführen.