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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie, 75. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 97. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 52. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

25. - 28.10.2011, Berlin

Die Chondrogenese von hMSZ wird durch rAAV-vermittelte Überexpression von humanem SOX9 stimuliert

Meeting Abstract

  • MadryM. Cucchiarini - Universitätsklinikum des Saarlandes, Experimentelle Orthopädie und Arthroseforschung, Homburg, Germany
  • M. Ekici - Universitätsklinikum des Saarlandes, Experimentelle Orthopädie und Arthroseforschung, Homburg, Germany
  • D.M. Kohn - Uniklinikum des Saarlandes, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg/Saar, Germany
  • H. Madry - Universitätsklinikum des Saarlandes, Experimentelle Orthopädie und Arthroseforschung, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 75. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 97. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 52. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 25.-28.10.2011. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2011. DocPO14-579

DOI: 10.3205/11dkou611, URN: urn:nbn:de:0183-11dkou6115

Veröffentlicht: 18. Oktober 2011

© 2011 Cucchiarini et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSZ) könnten Kandidatengene zur Verbesserung der Knorpelreparatur überexprimieren. Wir untersuchten die Hypothese, daß eine rAAV-vermittelte Überexpression des humaner Transkriptionsfaktors SOX9 die Chondrogenese von hMSZ stimuliert.

Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase (β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ) und humanes FLAG-hsox9 (rAAV-FLAG-hsox9). MSZ wurden aus dem Knochenmark von Patienten isoliert. Transduzierte Zellen (Passage 1-2) wurden für 21 Tage in Monolayer (20 µl rAAV/2x104 Zellen) oder in Aggregatkultur (100 µl rAAV/2x105 Zellen) in definiertem Medium kultiviert. Transgenexpression wurde mittels Immunfärbungen (FLAG, SOX9) bestimmt. Paraffinschnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt. Typ-II- und Typ-X-Kollagen wurden mittels Immunfärbungen nachgewiesen. Der Proteoglykan-Gehalt wurde durch DMMB ermittelt. Die Typ-II-Kollagen-Expression wurde durch eine Real-time PCR-Analyse bestimmt (SYBR Green, revers transkriberte Gesamt-RNS, mittels GAPDH normalisiert). Die Daten wurden mit der 2-DDCt Methode ermittelt. Morphometrische Messungen wurden an 3 standardisierten Stellen der Proben durchgeführt. Daten wurden geblindet von zwei individuellen Personen erhoben. Jede Kondition (n=3) wurde in zwei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In Monolayerkultur sowie in Aggregatkultur wurde SOX9 in rAAV-FLAG-hsox9-transduzierten Zellen überexprimiert und der FLAG-Tag nur in diesen Zellen nachgewiesen (Kontrolle: rAAV-lacZ). Chondrogene Differenzierung lag in beiden Gruppen nach 21 Tagen vor (Toluidinblaufärbung sowie Typ-II-Kollagen-Immunreaktivität), obwohl die Färbeintensität stärker in rAAV-FLAG-hsox9-transduzierten Aggregatkulturen war. Die Umfänge der Aggregatkulturen (5.112±546 mm) waren signifikant größer als von rAAV-lacZ-transduzierten Aggregatkulturen (3.223±185 mm; 1,6-fach; P <0.001). Der Proteoglykan-Gehalt war 7- bis 8-fach höher in rAAV-FLAG-hsox9-transduzierten Aggregatkulturen, verglichen mit rAAV-lacZ-transduzierten Aggregatkulturen. Die Real-time PCR-Analyse zeigte eine 16-fach höhere Typ-II-Kollagenexpression in rAAV-FLAG-hsox9-transduzierten Aggregatkulturen. Typ-X-Kollagen- Immunreaktivität war niedriger in diesen Aggregatkulturen im Vergleich mit rAAV-lacZ-transduzierten Aggregatkulturen.

Humanes SOX9 kann in hMSZ durch rAAV sowohl in Monolayer als auch in Aggregatkultur überexprimiert werden. Die Chondrogenese wird dadurch in dreidimensionaler Kultur signifikant stimuliert. Diese Ergebnisse könnten zur Verbesserung bestehender hMSZ-basierter, markraumeröffnender Verfahren verwendet werden.