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Fragestellung: Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) besitzen eine hohe Potenz zur Erneuerung von Gewebe. Für einen möglichen therapeutischen Einsatz im Bereich großer Knochendefekte können sie mit geeigneten Träger-Biomaterialien (z.B. poröse ß-Tricalciumphosphate) eingesetzt werden. Erste eigene klinische Erfahrungen zeigen eine optimale Handhabung in Kombination mit einem autologen Plasmaclot als Zell/Biomaterial-Trägermatrix. Ziel dieser in vitro-Studie war es, den Einfluss unterschiedlicher Calciumkonzentrationen bei der Herstellung einer Plasmaclotmatrix auf die Fibrin-Polymerisierung, Viskosität, Stabilität und Viabilität eingebetteter Stammzellen zu untersuchen.

Methodik: Zwei unterschiedliche Plasmen wurden durch Zentrifugation (thrombozytenhaltig P1: 700 xg 8 min, thrombozytenfrei P2: 2000 xg 45 min) aus Citrat-Blut freiwilliger Spender gewonnen. Plasma und RPMI1640-Zellkulturmedium wurden 1:1 (v/v) gemischt und durch Zugabe von 10-100 mM Calciumchlorid-Lösung zur Koagulation gebracht (90 min Zellkulturschrank). Zusätzlich wurden Plasmaclots mit eingebetteten mesenchymalen Stammzellen hergestellt (5x10⁵/ml Clotmix). Die Plasmaclot-Viskosität des flüssigen Clotanteils wurde mit einem Plasmadiffusionsassay und die Stabilität biomechanisch mit einem Clotperforations-Verfahren überprüft. Über REM-Aufnahmen wurde die Fibrinfaserdicke in fünf vorgegebenen Flächen ausgemessen. Die Zellviabilität und Proliferation der eingebetteten Stammzellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (Calcein-AM/PI Färbung) analysiert. Nach enzymatischer Auflösung der Plasmaclots mit Trypsin (0,25%) wurden die Zellen nach zwei Waschschritten für 1 Woche kultiviert (12-Loch-Platte) und abschließend die Zellmorphologie nach Pappenheimfärbung lichtmikroskopisch beurteilt.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Diffusion von flüssigem Plasma in Filterpapierstreifen war für P1-Clots in Kombination mit 10-60 mM Calcium 21-29 mm und mit 70-100 mM Calcium 61-76 mm. P2-Clots mit 10-60 mM Calcium erreichten eine Diffusionsstrecke von 24-26 mm und mit 70-100 mM Calcium 29-32 mm. Die Anwesenheit von Thrombozyten im Clot (P1) führte zu einer höheren Clot-Stabilität. Diese Ergebnisse korrelierten mit dem makroskopischen Erscheinungsbild der Clots. Beim Clotperforationstest zeigten P1- (0,27-0,20N) und P2-Clots (0,23-0,17N) mit 40-60 mM Calcium eine optimale Festigkeit. Zellviabilität und Zellproliferation eingebetteter MSCs waren bei P1- und P2-Clots ab 70-100 mM Calcium signifikant reduziert. Diese Ergebnisse belegen die Eignung von Plasmaclots, hergestellt aus Citratblut, für einen Zelltransfer nach Zugabe von 40-50 mM Calciumchlorid. Diese Clot-Zusammensetzungen (sowohl P1 als auch P2) kombinieren die optimale Handhabbarkeit und Stabilität mit guter Zellviabilität.