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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
74. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie
96. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie
51. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

26. - 29.10.2010, Berlin

In vitro-Inhibition von Sox9 reduziert die Bcl-2 Expression

Meeting Abstract

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  • S. Stöckl - Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany
  • C. Göttl - Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany
  • J. Grifka - Asklepios Klinikum Bad Abbach, Orthopädische Universitätsklinik, Bad Abbach, Germany
  • S. Grässel - Orthopädische Klinik der Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, ZMB im BioPark 1, Regensburg, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 74. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 96. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 51. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 26.-29.10.2010. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2010. DocEF11-857

DOI: 10.3205/10dkou005, URN: urn:nbn:de:0183-10dkou0051

Veröffentlicht: 21. Oktober 2010

© 2010 Stöckl et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Der Transkriptionsfaktor Sox9 ist imperativ für die Etablierung der Osteochondroprogenitorzelllinie, aus der sowohl Osteoblasten als auch Chondroblasten hervorgehen können.

Trotz seiner Schlüsselrolle während der Chondrogenese gibt es noch einige unklare Aspekte bzgl. der Sox9-Genregulation und dem temporären Einfluss des Sox9-Genexpressionsspiegels auf die einzelnen Differenzierungsstadien während der Chondrogenese und Osteogenese. Hinweise aus der Literatur deuten außerdem darauf hin, dass Sox9 an anderen biologischen Prozessen wie der Proliferation oder Apoptose beteiligt sein könnte. Um diese Fragestellungen untersuchen zu können, verwenden wir ein retroviral-basiertes RNAi-System, mit welchem wir in mesenchymalen Stammzellen der Ratte (rMSC) Sox9 mittels einer spezifischen shRNA herunter regulieren.

Methodik: rMSC wurden aus dem femoralen Knochenmark von 6 Wochen alten CD-Ratten isoliert, als Monolayer bis Passage 1 kultiviert und anschließend mit einer Sox9-spezifischen shRNA, mittels eines retroviralen Transduktionssystems (Clontech TM pSIREN), transduziert. Nach 2 Wochen Selektion wurde die Stärke des Sox9 Knockdowns auf RNA-Ebene durch quantitative real-time PCR und auf Proteinebene durch Western-Blot Analyse verifiziert. Der Effekt des Sox9 Knockdowns auf verschiedene, zum Teil downstream gelegene Gene, wurde mittels eines PCR pathway finder arrays (SA-Bioscience) untersucht und nachfolgend mit qPCR verifiziert. Die Zellproliferation nach Sox9 Reduktion wurde mit einem BrdU-ELISA quantifiziert und die apoptotische Aktivität anhand eines Caspase 3/7 Assay gemessen.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Via RNAi konnte ein reproduzierbarer Sox9 Knockdown von 50% bis 90% in primären rMSC erzeugt werden. Die Reduktion von Sox9 wurde auf transkriptioneller und proteinchemischer Ebene nachgewiesen. Als downstream Effekt des Sox9 Knockdowns konnte eine verringerte Expression von Col1a1, Sox5, VEGF, Integrin alpha 11, MMP-13 und Runx2 gemessen werden, während Sox6 eine unveränderte und Osteocalcin eine mehr als zweifach erhöhte Expression aufwiesen. Verglichen mit der Negativ-Kontrolle (scrambled RNA) ist die Proliferationsrate um 14% geringer, wenn Sox9 zu mehr als 50% inhibiert wurde.

Im Caspase 3/7 Assay kann eine Tendenz zu erhöhter apoptotischer Aktivität nach Sox9 Reduktion beobachtet werden. Eine um 50% verringerte Expression des anti-apoptotischen Gens Bcl-2 nach 50%iger Inhibition von Sox9 unterstützt diesen Trend. Unsere Ergebnisse zeigen einen positiven Effekt von Sox9 auf die Zellproliferation und geben Hinweise auf eine negative Regulierung der Apoptose durch Sox9. Ein Sox9 Knockdown korreliert mit einer Reduktion von Bcl-2 und könnte so zu verstärkter Apoptose in undifferenzierten MSC führen, z.B. um eine fehlerhafte Differenzierung zu verhindern. Da die mögliche Interaktion zwischen Bcl-2 und Sox9 noch vor Beginn der chondrogenen bzw. osteogenen Differenzierung stattfindet, deutet dies auf die wichtige Rolle von Sox9 für die Vitalität von multipotenten Vorläuferzellen hin.