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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
74. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie
96. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie
51. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

26. - 29.10.2010, Berlin

Chondrogene Differenzierung von Mesenchymalen Stammzellen mit Indian Hedgehog Gentransfer

Meeting Abstract

  • M. Weissenberger - Orthopädische Klinik, König-Ludwig-Haus, Orthopädisches Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, Würzburg, Germany
  • M. Kunz - Orthopädische Klinik, König-Ludwig-Haus, Orthopädisches Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Würzburg, Würzburg, Germany
  • U. Nöth - Orthopädische Klinik, König-Ludwig-Haus, Abt. für Tissue Engineering, Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, Würzburg, Germany
  • M. Rudert - Universität Würzburg, Orthop. Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, König-Ludwig-Haus, Würzburg, Germany
  • A. Steinert - Orthopädische Klinik, König-Ludwig-Haus, Orthopädisches Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Würzburg, Würzburg, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 74. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 96. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 51. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 26.-29.10.2010. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2010. DocEF11-768

DOI: 10.3205/10dkou004, URN: urn:nbn:de:0183-10dkou0046

Veröffentlicht: 21. Oktober 2010

© 2010 Weissenberger et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: In Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass sich mesenchymale Stammzellen (MSZ) für die Knorpelregeneration mittels Gentransfer von Mitgliedern der TGF-b Superfamilie zwar chondrogen differenzieren lassen, jedoch ein Hohes Maß an hypertropher Enddifferenzierung mit nachfolgender Apoptose aufweisen. Da der Transkriptionsfaktor Indian Hedgehog (IHH) als Modulator der Hypertrophie in der Wachstumsfuge beschrieben ist, untersucht diese in vitro Studie, ob Gentransfer von IHH alleine oder in Kombination mit TGF-b1, BMP-2 oder SOX9 in der Lage ist Chondrogenese in MSZ zu induzieren, und ob IHH zur Reduktion der hypertrophen Enddifferenzierung führt.

Methodik: Adenovirale Vektoren der ersten Generation wurden mittels Cre-lox Rekombination für IHH herstellt und wie die vorhandenen Vektoren für GFP, TGF-b1, BMP-2 und SOX9 verwendet. Humane adulte MSZ aus dem Knochenmark wurden nach adhärenter Kultur mit o.g. Vektoren bei jeweils 50 MOI (multiplicities of infection) mit IHH, TGF-b1, BMP-2 oder SOX9 alleine oder in Kombination infiziert. Danach wurden die jeweils genetisch-modifizierten MSZ als Pellets (jeweils 3*105 Zellen/Pellet) in chondrogenem Differenzierungsmedium (ITS/ Dexamethason/ Ascorbat) für 3 Wochen kultiviert. Untransduzierte und GFP-transduzierte Kulturen dienten als Kontrollen. Die Auswertung der Transgenexpressionen erfolgte mittels ELISA (TGF-b1, BMP-2), Western Blot (IHH/SOX9) und FACS (GFP), die der Chondrogenese und Hypertrophiestadien erfolgte histologisch, quantitativ biochemisch und mittels RT-PCR.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Wir konnten zeigen, dass der Gentransfer von IHH alleine und in Kombination geeignet ist MSZ in Pelletkultur chondrogen zu differenzieren (Alcianblau und Col2 pos), was sich auch quantitativ im GAG Assay mit vergleichbar hohen werten bestätigte. Die Kontrollen waren nicht chondrogen. Kulturen, die mit IHH, TGF-b1, und BMP-2 alleine oder in Kombination chondrogen induziert wurden zeigten eine stärkere Hypertrophie (ALP, Col10), als die Pellets nach Modifikation mit SOX9 alleine oder SOX9/IHH. Dies bestätigten die RT-PCR Analysen, die eine vergleichbare Expression knorpelspezifischer Markergene (Col2, 9, 11, Aggrecan) und eine höhere Expression Hypertrophie-assoziierter Markergene (ALP, OP, Col10) in den IHH, TGF-b1, und BMP-2 enthaltenden Kulturen im Vergleich zu den Kulturen, die mit SOX9 alleine oder zusammen mit IHH transduziert wurden.

Wir konnten somit zeigen, dass MSZ in vitro mit IHH Gentransfer alleine und in Kombination chondrogen differenziert werden können, dass es jedoch nicht möglich war, mit IHH alleine die chondrogene Hypertrophie zu inhibieren. Eine Modulation der Hypertrophie war lediglich in durch SOX9 alleine oder in Kobination mit IHH möglich. Ob die Reduktion der hypertrophen Enddifferenzierung von chondrogen differenzierten MSZ mittels IHH/SOX9 Gentransfer letztlich zur Erzeugung von langzeitstabilem Neoknorpel in vivo beitragen kann, sollen die derzeit laufenden Tierexperimente zeigen.