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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
73. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie
95. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie
50. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

21. - 24.10.2009, Berlin

Vergleichende Analyse achtzehn nicht-viraler Transfektionsreagenzien zum Gentransfer in humane Meniskuszellen und dreidimensionaler Kultur

Meeting Abstract

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  • H.-P. Lee - National Tsing Hua University, Department of Chemical Engineering, Hsinchua, Taiwan, Republic of China
  • S. Heiligenstein - Universitätskliniken des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany
  • D.-M. Kohn - Universitätskliniken des Saarlandes, Klinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, Homburg, Germany
  • H. Madry - Universitätskliniken des Saarlandes, Orthopädische Klinik, Labor f. Experimentelle Orthopädie, Homburg, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 73. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 95. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 50. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 21.-24.10.2009. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2009. DocPO10-1223

DOI: 10.3205/09dkou593, URN: urn:nbn:de:0183-09dkou5935

Veröffentlicht: 15. Oktober 2009

© 2009 Lee et al.
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Gliederung

Text

Fragestellung: Transplantation von genetisch modifizierten Meniskuszellen ist eine potentielle Methode zur Reparatur von Meniskusdefekten. Wir testeten die Hypothese, dass neuartige, optimierte, nicht-virale Vektoren effizient und sicher in der Lage sind, humane Meniskuszellen zu transfizieren. Im Hinblick auf eine spätere klinische Anwendung wurde die Transgenexpression in dreidimensionaler Kultur ermittelt.

Methodik: Meniskuszellen aus Meniskusgewebe eines Erwachsenen (hMC) und eines Kindes (hMCy) wurden isoliert, in Monolayer kultiviert und in Passage 3–4, bzw. 5–8 mit dem Luziferase-Gen (pCMVluc) und dem E.coli lacZ-Gen (pCMVlacZ) transfiziert. Zum Gentransfer wurde FuGENE 6 (Roche), GeneJammer (Stratagene), TurboFectin 8 (ORIGENE), Lipofectamin2000 und DMRIE-C (beide Invitrogen), Metafectin (Biontex), Nanofectin1 und 2 (beide PAA), Calciumphosphat, TransPass (NEB), Escort III (Sigma), Dreamfect, EcoTransfect, DreamFect Gold (alle OZ Biosciences), JetPEI (Polyplus), SuperFect (Qiagen), GeneJuice (Novagen), TransIT-LT1 (Mirus) eingesetzt (Lipid/DNS-Ratio 3:1, 4 U/ml Hyaluronidase). Nach 2 Tagen wurden Transfektionseffizienz (X-Gal-Färbung), Viabilität der transfizierten Zellen (MTT-Test) und Luziferase-Aktivität (Chemolumineszenz; Promega) bestimmt. Transfizierte Zellen wurden im Monolayer, in Zellpellets und verkapselt in Alginatssphäroiden (Sigma, 1,2%ige-Lösung, 5x10e6 Zellen/ml) kultiviert. Transgen-Expression wurde an Tag 1, 2, 4, 6, 8 und 11 bestimmt. Der Mann-Whitney-Rank-Sum-Test bestimmte die Signifikanz.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Transfektionsreagenzien FuGENE 6, GeneJammer, TurboFectin 8, GeneJuice sowie Calciumphosphat zeigten nur minimale Toxizitäten (Viabilitäten über 60% in hMC und hMCy). Transfektion mit Nanofectin 1, Nanofection2 und JetPEI resultierte in schlechteren Viabilitäten (29%; 24% und 26% in hMC und 17%, 20% und 19% in hMCy). Die höchste Luziferase-Aktivität in hMC wurde durch Nanofectin 2 erreicht (816 RLU/lebende Zelle), gefolgt von JetPEI (785 RLU/lebende Zelle) und GeneJammer (534 RLU/lebende Zelle). In hMCy-Zellen wurden maximale Transgenexpressionen mit JetPEI, Nanofectin 2 und DMRIE-C erzielt (2695, 2570, und 2029 RLU/lebende Zelle). Maximale Transfektionseffizienzen lagen bei 8,6% in hMC und 8,4% in hMCy bei der Transfektion mit Lipofectamin2000. Nanofectin 2 und JetPEI zeigten Werte von 4,4% (hMC) und 4,7% (hMCy). Die Trangenexpression in unterschiedlichen Kulturmethoden nahm über die Zeit kontinuierlich ab und erreichte an Tag 10 im Monolayer, an Tag 4 in Zellpellets und Tag 6 in Alginatsphäroiden den Wert 0 (P>0,05 im Vergleich zur Kontrolle). Zusammenfassend erwies sich Nanofectin 2 und JetPEI als die geeignetsten, um Gene in humane adulte und juvenile Meniskuszellen zu transferieren. Eine Transgenexpression konnte über 4–6 Tage in 3D-Kultursystemen nachgewiesen werden. Die Daten unterstützen das Konzept einer Anwendung von therapeutischem nichtviralem Gentransfer in humane Meniskuszellen zur Entwicklung von neuen Therapien von Meniskusläsionen.