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Reduktion des Dedifferenzierungspotenzials arthrotischer Chondrozyten für die ACT (autologe Chondrozyten-Transplantation) durch Minimalmedium
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Autoren
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S. Neumann
- Waldkrankenhaus 'Rudolf-Elle' gGmbH mit, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
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A. Brodhun
- Waldkrankenhaus 'Rudolf-Elle' gGmbH mit, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
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C. Voigt
- Waldkrankenhaus 'Rudolf-Elle' gGmbH mit, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
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J. Mollenhauer
- Naturwissenschaftl. und Mediz. Institut (NMI), Universität Tübingen, Reutlingen, Germany
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O. Pullig
- Waldkrankenhaus 'Rudolf-Elle' gGmbH mit, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Jena, Eisenberg, Germany
| Veröffentlicht: | 9. Oktober 2007 |
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Gliederung
Text
Fragestellung: Für die Herstellung großflächiger Gelenkknorpeltransplantate bedarf es Techniken, bei denen Chondrozyten aus arthrotischem Knorpelgewebe so isoliert werden, dass die chondrogenen Eigenschaften erhalten bleiben. Da bereits bei der enzymatischen Isolierung der Chondrozyten ein veränderter Phänotyp induziert wird, war Ziel dieser Untersuchung den chondrozytären Phänotyp durch Optimierung des Isolationsmediums zu stabilisieren.
Methodik: Es wurden parallel zwei Extraktionen von einem arthrotischen Knorpelgewebe durchgeführt. Nach 24-stündiger Isolation der Zellen in einem nährstoffreduzierten Medium (Minimalmedium [MM]) bzw. im Standardmedium DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) wurden die Zellen in ein Kollagen Typ I-Gel (CaReS®) eingebracht (3D-Kultur) und für 14 Tage in DMEM bei 37°C kultiviert. Sowohl nach Isolations- als auch Kultivierungsphase wurde das Genexpressionsmuster (Kollagen Typ I, Typ II, Matrixmetalloproteinase 3 (MMP3)) durch quantitative real-time-PCR (qRT-PCR) bestimmt. Zur Quantifizierung der jeweiligen mRNA wurden sequenzspezifische Standards mitgeführt. Die Expressionsstärke (Kopienzahl/µl) wurde auf GAPDH als „Housekeeping“-Gen normiert. Zudem erfolgte die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase (AP)-Aktivität (Marker für Hypertrophie) unter Verwendung eines Chemilumineszens-Assays.
Ergebnisse: Die Isolation der Chondrozyten in Minimalmedium ergab allgemein eine Reduktion des Stoffwechsels (qRT-PCR). Die Kollagen Typ I-Expression (DMEM: 0,4; MM: 0,16) sowie die Kollagen Typ X-Expression (DMEM: 0,05; MM: 0,01) waren verringert, während die des Kollagen Typ II (DMEM: 9,2; MM: 11) vergleichbar mit dem Standardmedium blieb. Des Weiteren führte die Verwendung des Minimalmediums zu einer signifikant erhöhten MMP3-Expression (DMEM: 6,2; MM: 12,4). Die durch Minimalmedium induzierte Reduktion der Kollagen Typ I-Expression blieb auch nach 14-tägiger 3D-Kultur konserviert. Die während der Isolation in beiden Medien erhöhte Genexpression von MMP3 nahm in der 3D Kultur deutlich ab (DMEM: 0,06; MM: 0,04). Mediumabhängige Auswirkungen auf die AP-Aktivität zeigten sich erst in der 3D-Kultur. Die Extraktion in Minimalmedium führte hier zu einer Abnahme der AP-Aktivität.
Schlussfolgerungen: Durch ein günstigeres Kollagen Typ II/Typ I-Verhältnis erwies sich die Chondrozytenisolierung in Minimalmedium als vorteilhaft. Dies blieb auch während der 3D-Kultivierung im DMEM erhalten. Auch in Bezug auf die AP-Aktivität lässt sich ein positiver Einfluss durch Extraktion in Minimalmedium und anschließender 3D-Kultivierung erkennen. Da dieser Effekt erst in der Kultivierungsphase nachweisbar ist, ist davon auszugehen, dass durch das Minimalmedium Regulationsmechanismen der Dedifferenzierung supprimiert werden.
