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Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie
71. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 93. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie und 48. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie und Unfallchirurgie

24. - 27.10.2007, Berlin

Retroviral induzierte in vitro Inhibition des Transkriptionsfaktors Sox9

Meeting Abstract

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  • S. Grässel - Poliklinik und Klinik für Orthopädie, Universität Regensburg, Experimentelle Orthopädie, Bad Abbach, Germany
  • C. Göttl - BioPark I, Universität Regensburg, Zentrum für Medizinische Biotechnologie, Regensburg, Germany
  • N. Ahmed - BioPark I, Universität Regensburg, Zentrum für Medizinische Biotechnologie, Regensburg, Germany

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie. 71. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, 93. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie, 48. Tagung des Berufsverbandes der Fachärzte für Orthopädie. Berlin, 24.-27.10.2007. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2007. DocE16-538

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dkou2007/07dkou052.shtml

Veröffentlicht: 9. Oktober 2007

© 2007 Grässel et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: Der Transkriptionsfaktor Sox9 reguliert fast die gesamte Kaskade der chondrogenen Differenzierung. Viele unverstandene und unbekannte Aspekte bezogen auf Sox9 und seinen “downstream” differenzierungspezifischen Signalwegen schließen Sox9- Genregulation, Redundanzen mit anderen Sox-Familienmitgliedern, den Einfluss des Sox9-Genexpressionslevels auf das spezielle Differenzierungsstadium und den direkten sowie indirekten Einfluss von Sox9. Da Sox9-homozygote Knockout-Mäuse aufgrund postnataler Mortalität nicht zur Verfügung stehen, sind neue innovative Techniken zur funktionalen Analyse von Sox9 imperativ. Eine derartige Option zur Entwicklung eines geeigneten Modellsystems stellt der in vitro „knockdown“ von Genen via RNA-Interferenz (RNAi) dar. In dieser Studie haben wir das Sox9-Gen in der murinen Fibroblastenzelllinie NIH3T3 inhibiert, indem wir Sox9 - spezifische shRNAs designed für ein retrovirales Vektorsystem, generiert haben.

Methoden:Mit Hilfe von Clonetech™ Algorithmen selektierte shRNAs wurden in das RNAi-ready pSIREN retroQ plasmid Expressionsvektor-System kloniert. Die EcoPak 293-2 „packaging“ Zelllinie wurde mit positiv-klonierten Plasmiden unter Verwendung von Lipofectamine2000 transfiziert. Das, die shRNA exprimierenden Viren, enthaltende Kulturmedium wurde nach 48 Std. abgenommen und ein 105 CFU enthaltender Virustiter wurde zur Transduktion von 1.5 x104 NIH3T3 Zellen in Gegenwart von 6µg/ml Polybrene verwendet. Nach 24 Std. wurden die Zellen mittels Trypsinverdau geerntet, gepoolt und zur Analyse von RNA- und Proteinexpression aufgearbeitet. Der Genexpressionsspiegel wurde mittels quantitativer RT-PCR ermittelt und die Proteinexpression wurde mittels Westernblot-Analyse bestimmt.

Ergebnisse: Die Transduktionseffizienz wurde durch Bestimmung des Genexpressionsspiegels von Sox9, normalisiert auf endogenes β-Actin, mit quantitativer PCR evaluiert. Ein Durchschnittswert von 80% Sox9- Inhibition wurde im Vergleich zu den Kontrollen ermittelt, welche mit Luziferase – shRNA transduziert worden waren. Nahezu 100% Abwesenheit des Sox9 – Proteins diente der Bestätigung des Knockdown-Effektes. „Downstream” Effekte der Sox9 Inhibition wurden durch relative mRNA Expression der drei Transkriptionsfaktoren Sox4, Sox6 und Tbox2 ermittelt und mit den Kontrollen verglichen. Die Ergebnisse zeigen eine klare Herunterregulierung von Sox6, während Tbox2 (1.4 fach) und Sox4 (1.8 fach) nicht-signifikant erhöht waren und daher relativ unbeeinflusst von der Abwesenheit von Sox9 erschienen.

Diskussion: Wir haben Sox9 durch Induktion von RNAi unter Verwendung von shRNAs, kloniert in einen retroviralen Genexpressionsvektor, in NIH 3T3 Zellen erfolgreich inhibieren können. Wir konnten durchschnittlich 80% Inhibition der Genexpression und fast 100% Inhibition auf dem Proteinlevel erreichen. Da das Housekeeping - Protein β-Actin nicht beeinflusst wurde, postulieren wir eine Sox9 spezifische Geninhibition, welche nicht von einem RNAi verursachten unspezifischen Effekt oder einem viralen Interferon vermittelten “off target” Mechanismus stammte. Eine verminderte Genexpression von Sox6, ein “downstream” von Sox9 agierender Transkriptionsfaktor, diente der Validierung der Inhibition der Genexpression zusammen mit den unbeeinflussten Sox4 and Tbox2 mRNA Expressionsspiegeln.

Diese in vitro Pilotstudie dient als Grundlage zur Untersuchung von Sox9 inhibierten primären adulten Mesenchymalen Stammzellen. Hier wollen wir bis dato unbekannte Signalfaktoren, redundante Gene und unidentifizierte Gene analysieren, die in die chondrogene Differenzierung involviert sind.