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Vierfache polychrome Sequenzmarkierung zur fluoreszenzmikroskopischen Charakterisierung des Knochenwachstums nach adenoviralem Gentransfer von Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) in einem Femurdefektmodell an der Ratte
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Autoren
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C.W. Müller
- Unfallchirurgische Klinik, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Germany
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M. van Griensven
- Experimentelle und klinische Traumatologie, Ludwig Boltzmann Institute, Wien, Austria
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K. Hildebrandt
- Klinik für kleine Haustiere, Tierärztliche Hochschule, Hannover, Germany
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M. Fehr
- Klinik für kleine Haustiere, Tierärztliche Hochschule, Hannover, Germany
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C. Krettek
- Unfallchirurgische Klinik, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Germany
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T. Gerich
- Unfallchirurgische Klinik, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Germany
| Veröffentlicht: | 28. September 2006 |
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Gliederung
Text
Fragestellung: Fluorochrome Azofarbstoffe werden mit dem Knochenwachstum stabil in den Knochen inkorporiert und ermöglichen nach Aufarbeitung eine fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung. Ziel dieser Arbeit war der Nachweis der erwarteten vermehrten Knochenbildung und die Darstellung ihres zeitlichen Ablaufes nach lokaler Applikation von rekombinantem BMP-2 und nach adenoviralem Gentransfer von BMP-2 in einem Femurdefektmodell an der Nacktratte.
Methodik: Lösungen von vier Azofarbstoffen - Calcein-Grün, Alizarin, Xylenol-Orange und Tetrazyklin - wurden hergestellt. 80 Rowett-Nackt- (rnu) und Lewisratten wurden operiert. Ein Critical-Size-Defekt der Diaphyse von 4mm wurde erzeugt und mittels K-Draht stabilisiert. Tricalciumphosphatplättchen wurden mit humanen Knochenstromazellen in Kombination mit rekombinantem BMP-2 oder adenoviralen BMP-2 Vektoren besiedelt und in den Defekt implantiert. Nach 0, 3, 6 und 9 Wochen wurde der jeweilige Azofarbstoff subkutan verabreicht. Nach 12 Wochen wurden die Tiere geopfert und Dünnschliffpräparate der Femora hergestellt. Unter Fluoreszenzmikroskopie erfolgte die semiquantitative Bewertung des Knochenwachstums nach Flächen (Anreicherung am Frakturspalt) und Banden (periostale Antreicherung) mit 0 (keine Fluoreszenz) bis 3 (maximale Fluoreszenz) Punkten.
Ergebnisse: In den rnu-Ratten, die mit BMP-2 behandelt worden waren, fanden sich signifikant höhere Punktwerte für Calceingrün-Fluoreszenz am Frakturspalt als in rnu-Ratten ohne BMP-2 (p<0.05). Die übrigen Farbstoffe wurden am Frakturspalt nicht signifikant unterschiedlich angereichert. Dagegen fand sich eine signifikant erhöhte Banden- (periostale) Fluoreszenz in BMP-2 Gruppen für alle vier Farbstoffe. In Lewis-Ratten fanden sich generell signifikant höhere Punktwerte als in Nacktratten ohne BMP-2. Zwischen den BMP-2 Gruppen (rekombinantes BMP-2 vs. adenovirale BMP-2 Vektoren) bestand kein signifikanter Unterschied.
Schlussfolgerungen: Im Bereich des Frakturspaltes konnte eine erhöhte Flächenfluoreszenz in den mit BMP-2 behandelten Tieren lediglich für das initial applizierte Calceingrün gezeigt werden, daraus folgt, dass ein lokaler Effekt des Wachstumsfaktor wohl initial vorhanden, nach Ablauf der ersten drei Wochen aber nicht mehr signifikant ist. Die frakturferne periostale Anreicherung ist hingegen auch nach sechs und neun Wochen noch in den BMP-2 behandelten Tieren erhöht. Wir postulieren daher, dass hier über den lokalen osteoinduktiven Effekt hinaus BMP-2 mittelbar auch systemisch wirkt. Die niedrigere Anreicherung in rnu-Ratten verglichen mit den immunkompetenten Lewis-Ratten führen wir auf die Leukopenie durch die Thymusaplasie der rnu-Ratten zurück, die auch eine eingeschränkten Geweberegeneration bedingt.
