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Optimierter Gentransfer in mesenchymalen Stammzellen zur Knorpelregeneration
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Veröffentlicht: | 28. September 2006 |
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Fragestellung: Gentransfer hat sich als effektive Methode herausgestellt, um chondrogene Faktoren in Knorpelläsionen in therapeutischen Konzentrationen darzureichen. Gentransfer von Faktoren wie TGF-ß1 oder BMP-2 hat sich als geeignete Methode herausgestellt, um mesenchymalen Stammzellen (MSZ) in vitro und in vivo chondrogen zu differenzieren. In dieser in vitro-Studie möchten wir die Frage klären, ob die Ko-Expression von IGF-1 in der Lage ist, die Knorpeldifferenzierung von MSZ durch TGF-ß1 oder BMP-2 in Pelletkultur und in Kollagen-Hydrogel-Konstrukten weiter zu verbessern.
Methode: Humane und bovine MSZ wurden nach adhaerenter Kultur mit adenoviralen Vektoren für IGF-1, TGF-ß1 oder BMP-2 allein oder in Kombination mit jeweils 25 iu (infectious units) infiziert. Danach wurden die jeweils genetisch-modifizierten MSZ in Pellets oder paprallel in Typ I Kollagen-Hydrogelen (jeweils 3*105 Zellen/Pellet oder 200 µL Gel) in chondrogenem Differenzierungsmedium (ITS/Dexamethason/Ascorbat) für 3 Wochen kultiviert. Nicht-modifizierte und GFP-transduzierte Kulturen dienten als Kontrollen.
Ergebnisse: Die resultierenden Transgenexpressionsraten (ELISA) lagen bei den jeweils entsprechend genetisch-modifizierten Pellet- und Hydrogelkulturen um die 100 ng/mL TGF-ß1, 120 ng/mL BMP-2 und 80 ng/mL IGF-1. Beim kombinierten Gentransfer von Ad.TGF-ß1 mit Ad.IGF-1, bzw. von Ad.BMP-2 mit Ad.IGF-1 zeigten sich jeweils grössere Pellets und Konstrukte, gesteigerte GAG/DNA Syntheseraten (DMMB und Hoechst-Dye-Methode), stärkere Färbungen für Proteoglykane (Toluidinblau) und Typ II und X Kollagen (Immunhistochemie), sowie frühere Expression knorpelspezifischer Markergene (RT-PCR von Typ II und X Kollagen, Aggrecan u.a.) im Vergleich zu den Pellets und Konstrukten nach Gentransfer mit jeweils nur einem der Vektoren. Die Kontrollen (Nicht- oder GFP-modifiziert), sowie die nur IGF-1 transduzierten Kulturen zeigten sowohl in den Pellets, als auch in den Hydrogelkonstrukten keine chondrogene Differenzierung.
Schlussfolgerungen: IGF-1 zeigt in Kombination mit TGF-ß1, bzw BMP-2 synergistische Effekte bei der chondrogenen Differenzierung von MSZ in vitro. Dies kann als effektive Strategie zur Herstellung gentherapeutisch optimierter MSZ-Hydrogel-Konstrukte für die Knorpelregeneration in vivo angesehen werden.