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125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

22. - 25.04.2008, Berlin

Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die Expression von humanem β2-Defensin in Darmepithelien – In-vitro-Untersuchungen im Modell mit der epithelialen Zelllinie HT-29

Meeting Abstract

  • A. Coordes - Chirurgische Klinik I, CBF, Charité Berlin
  • A. Andreou - Chirurgische Klinik I, CBF, Charité Berlin
  • U. Erben - Medizinische Klinik für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • Th. Stroh - Medizinische Klinik für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • K. Blunert - Medizinische Klinik für Gastroenterologie, Infektiologie und Rheumatologie, Campus Benjamin Franklin, Charité
  • H.J. Buhr - Chirurgische Klinik I, CBF, Charité Berlin
  • corresponding author N. Slavova - Chirurgische Klinik I, CBF, Charité Berlin
  • A.J. Kroesen - Chirurgische Klinik I, CBF, Charité Berlin

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. Berlin, 22.-25.04.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc08dgch9744

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2008/08dgch683.shtml

Veröffentlicht: 16. April 2008

© 2008 Coordes et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: Bei Morbus Crohn ist die intestinale Mukosabarriere gestört und eine zelluläre, u.a. zytokinvermittelte Immunantwort gegen die kommensale luminale Flora sowie eine gestörten Defensin-Homöostase wurden beschrieben. Humanes β2-Defensin (HBD-2) wird translational reguliert und durch bisher nicht ausreichend bekannte Mechanismen induziert. In einem Modell mit der humanen epithelialen Zelllinie HT-29 wird auf Transkriptions- und Proteinebene der Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf HBD-2 analysiert.

Material und Methoden: HT-29-Zelllen wurden mit den rekombinanten humanen Zytokinen Interleukin (IL)-1β, Tumornekrosefaktor (TNF)α, IL-6 bzw. IL-17 in verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Durch semi-quantitative Polymerasekettenreaktion mit spezifischen Primern für HBD-2 und Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase wurden die Mengen der HBD-2-mRNA abgeschätzt. Im HBD-2-spezifischen Western-blot wurden Zellkulturüberstände und Lysate IL-1β-behandelter HT-29-Zellen sowie durch Elektroporation transfizierter HT-29-Zellen, die ein Fusionsprotein von HBD-2 mit einem grün fluoreszierenden Protein (EGFP) unter der Kontrolle eines starken Promotors exprimierten, mit rekombinantem HBD-2 und Darmpräparaten verglichen.

Ergebnisse: Unabhängig vom Serumgehalt im Medium wurde in HT-29-Zellen unter Standardkulturbedingungen keine mRNA für HBD-2 gefunden. Die Zugabe von IL-1β stimulierte zeit- und konzentrationsabhängig die Expression von HBD-2. Entsprechende erhöhte mRNA wurde noch nach 72 Stunden nachgewiesen. Die Zytokine TNFα, IL-6 bzw. IL-17 allein hatten keinen Effekt. Die Wirkung von IL-1β auf die HBD-2-spezifische mRNA wurde durch TNFα nicht verändert.Im Western-blot mit Zellkulturüberständen und Lysaten von 1x106 HT-29-Zellen nach Stimulation mit IL-1β sowie mit Epithelzellpräparaten aus menschlichem Darmgewebe wurde mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern für humanes HBD-2 keine spezifische Bande in der erwarteten Größe um 5 kDa gefunden. Es wurde jedoch HBD-2 vor dem Hintergrund aller zellulären Proteine den Bedingungen der Standardaufarbeitung ausgesetzt, waren für die sichere Darstellung mindestens 100 pmol HBD-2 notwendig. Diese Mengen wurden unter den Bedingungen der Induktion von HBD-2 durch IL-1β und in den Darmproben nicht erreicht. Keiner der im Western-blot verwendeten Antikörper war für eine Anreicherung von HBD-2 aus Kulturüberständen oder Zelllysaten durch Immunpräzipitation geeignet. Bei einer Effizienz der Transfektion des Plasmids für das HBD-2-EGFP-Fusionsprotein in HT-29-Zellen um 70% wurde konstitutiv expimiertes und sezerniertes HBD-2-EGFP mit einer Größe von ~38 kDa sowohl in Lysaten aus 1x105 Zellen als auch aus Kulturüberständen direkt gezeigt.

Schlussfolgerung: Die auf Transkriptionsebene in der Zelllinie HT-29 gezeigte Induktion der HBD-2-Expression durch das proinflammatorische IL-1β unterstützt die Annahme, dass die Defensinproduktion in nicht nur direkt durch Bakterien sondern auch indirekt durch über zellproduzierte Zytokine in den Darmepithelien reguliert wird. Unter diesen Bedingungen reicht die Sensitivität des Proteinnachweises im Western-blot nicht aus. Mit dem konstitutiv in HT-29-Zellen exprimierten und sezernierten HBD-2-EGFP-Fusionsprotein können Methoden zur Anreicherung und Darstellung des HBD-2-Proteins aus Zellysaten und Zellkulturüberständen etabliert und optimiert werden.