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125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

22. - 25.04.2008, Berlin

Einsatz muriner mesenchymaler Stammzellen zur Expression spenderspezifischer MHC Klasse I Moleküle zur spenderspezifischen Immunsuppression in der allogenen Organtransplantation

Meeting Abstract

  • corresponding author P. Camaj - Chirurgische Klinik und Poliklinik, LMU München, Klinikum Großhadern, München, Deutschland
  • C. Heeschen - Chirurgische Klinik und Poliklinik, LMU München, Klinikum Großhadern, München, Deutschland
  • K.-W. Jauch - Chirurgische Klinik und Poliklinik, LMU München, Klinikum Großhadern, München, Deutschland
  • E. K. Geissler - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Universität Regensburg, Regensburg
  • C. Graeb - Chirurgische Klinik und Poliklinik, LMU München, Klinikum Großhadern, München, Deutschland

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. Berlin, 22.-25.04.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc08dgch9264

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2008/08dgch635.shtml

Veröffentlicht: 16. April 2008

© 2008 Camaj et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: Die Organabstoßung ist vor medikamentenbedingten Nebenwirkungen eines der Hauptprobleme der Transplantation. Lange besteht der Wunsch nach einer spenderspezifischen Immunsuppression (IS) ohne bzw. mit stark reduzierter medikamentöser IS. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, daß lösliche MHC-Moleküle eine spenderspezifischen IS induzieren können. Es fehlten jedoch geeignete Vektoren die Moleküle in ausreichender Menge im Empfänger zu exprimieren. Insbesondere virale Vektoren haben die hohen Erwartungen nicht erfüllt. In den aktuellen Versuchen beschreiben wir die Möglichkeit spenderspezifische MHC Moleküle mittels immortalisierter muriner Stammzellen (mMSC), die ihrerseits die Potenz einer immunsuppressiven Wirkung besitzen können, zu exprimieren.

Material und Methoden: Material und Methoden: Genkonstrukt: PCR-Klonierung des Maus-MHC Klasse I Gen H2Dd spezifisch für den Mausstamm DBA2. Isolierung von RNA aus Mausmilzpräparaten, der Gen wurde amplifiziert durch RT-PCR mit Superscript III one step RT-PCR Platinum High Fidelity Taq system, Klonierung mittels Topoisomerasereaktion in den Vektor pcDNA3.2 GW/V5.Lösliches H2Dd-Genkostrukt: Fusion der Genfragmente H2Dd mit der Region für das lösliche Ratten-MHC-Molekül Q10a mittels PCR (H2DdQ10a), nach Identifizierung durch Proteinsequenzanalyse. Analog erfolgte die Klonierung der membrangebundenen Form H2Dd. Anschließend erfolgte die Transfektion der mMSC mit linearer DNA.Western Blotting: membrangebundene MHC-Moleküle wurden aus Zelllysaten in Complete M EDTA-free lysis buffer präpariert, die lösliche Form wurden aus mittels Ultrafiltration durch Vivaspin 500 Säulen angereicherter Kulturüberstände isoliert. Die Proteine wurden mit 12% SDS-PAGE separiert, auf PVDF Membrane transferiert und mit anti- H2Dd-Antikörper (Ak) und HRP-Anti-Maus-Ak detektiert.FACS: Die FACS-Analyse der Zellen erfolgte mit anti-H2Dd-Ak und FITC-Anti-Maus-Ak Färbung sowie antiidiotypische Ak-Negativkontrolle.ELISA: zur Konzentrationsbestimmung löslicher und membrangebundener H2Dd-Molküle aus Gewebe/Serum bzw. Lysaten und Kulturüberständen entwickelten wir zudem einen mittels biotinylierte-Anti-H2Dd-Ak spezifischen ELISA.

Ergebnisse: Mittels o.g. Methodik war es mögliche durch PCR-Klonierung sowohl eine lösliche (H2DdQ10a) als auch einer membrangebundene Form des Maus MHC Klasse I Moleküls H2Dd zu generieren und dies mittels Sequenzierung zu bestätigen. Die anschließende stabile Transfektion immortalisierter, spenderspezifischer mMSC (C57 BL/6) konnte durch Western Blotting und FACS-Analyse bestätigt werden. Die Quantifizierung der Molekülexpression in den Kulturschalen erfolgte mittels Antigen-spezifischen ELISA, wobei die Expressionmenge der Stammzellen die von Hepatozytenkulturen aus Vorversuchen erreichte (1000-1600 ng/ml/1x106 Zellen). Nach i.v. Zellinjektion GFP-transfizierter mMSC war neben dem Nachweis der Zellen in Leber, Lunge und Milz auch ein Nachweis in peripherern Lymphknoten möglich.

Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse haben gezeigt dass mMSC geeignet sind spenderspezifische MHC Klasse I Moleküle sowohl in löslicher als auch in membrangebundener Form in adäquater Menge zu exprimieren. Immortalisierte MSC bieten dabei den für einen immunsuppressiven Effekt löslicher Antigene wichtigen Vorteil, daß sie sowohl als syngener als auch als allogener Vektor vor einer Transplantation generiert werden könnten, selbst wenig immunogen sind und unter Umständen einen immunmodulativen Effekt unterstützen.